蛋白質(zhì)分離純化的方法

蛋白質(zhì)的分離純化方法很多,，主要有：

（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1,、蛋白質(zhì)的鹽析
　　中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響,，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶,；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時,，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析,，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中,，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,，使之“失水”,，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好,。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小,、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀,。
　　影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行,。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低,。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白,、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低,，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時在濃鹽溶液中的溶介度zui低,。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時,，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%,。
　　蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽,，主要有硫酸銨、硫酸鎂,、硫酸鈉,、氯化鈉、磷酸鈉等,。 其中應(yīng)用zui多的硫酸銨,，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升,；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升）,，在這一溶解度范圍內(nèi),，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,，不易引起蛋白質(zhì)變性,。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時,，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié),。
　　蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去,，常用的辦法是透析,，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析,，并不斷的更換緩沖液,，因透析所需時間較長，所以在低溫中進(jìn)行,。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,，所用的時間就比較短。

2,、等電點(diǎn)沉淀法
　　蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力zui小,，因而溶解度也zui小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別,，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀,，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用,。

3,、低溫有機(jī)溶劑沉淀法
　　用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇,，乙醇或丙酮,，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性,，應(yīng)在低溫下進(jìn)行,。

（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾
　　透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開,。
　　超濾法是利用高壓力或離心力,，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上,，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì),。

2、凝膠過濾法
　　也稱分子排阻層析或分子篩層析,，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物zui有效的方法之一,。柱中zui常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。

（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同,，可將其分開,。

1、離子交換層析法
　　離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素,；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素,；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時,，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。
 

2,、電泳法
　　各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下,，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,，電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時,，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止,，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。