單克隆抗體制備常見問題分析

一,、免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施

有時不能獲得滿意的抗血清,，可從下列幾方面找原因,，并改進之,。

1,、免疫動物的種屬及品系是否合適,，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數(shù)量,。

2,、抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號,，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu),，或改進提取方法。

3,、制備的免疫原是否符合要求,，可從偶聯(lián)劑，載體,、抗原或載體的比例,、反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進,。

4,、所用的佐劑是否合適，乳化是否*,，可改用其它佐劑,，或加強乳化。

5、免疫的方法,、劑量,，加強免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適,。

6,、動物的飼養(yǎng)是否得當，如營養(yǎng)（飼料,、飲水）,、環(huán)境衛(wèi)生（通風、采光,、溫度）是否符合要求,，動物的健康情況是否良好等。

二,、制備單克隆抗體影響因素,、失敗原因分析

由于制備McAb的實驗周期長，環(huán)節(jié)多,，所以影響因素就比較多,，稍不注意就會造成失敗。

其主要失敗原因和影響因素有

1,、污染

包括細菌,、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中zui辣手的問題,。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之,，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清,，此外,，其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染,。在有條件的實驗室,，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細胞系進行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時采取措施處理,。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學(xué)的過濾方法,，將污染的雜交瘤細胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時,，犖^菌取出分離雜交瘤細胞,，一般可除去支原體污染。

2,、融合后雜交瘤不生長

在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素

（1）PEG有毒性或作用時間過長,。

（2）牛血清的質(zhì)量太差,，用前沒有進行嚴格的篩選。

（3）骨髓瘤細胞污染了支原體,。

（4）HAT有問題,，主要是A含量過高或HT含量不足。

3,、雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體

（1）融合后有細胞生長,，但無抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變,，變成A抵抗細胞所致,。

（2）有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好,。

（3）對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮?，可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長,，從而抑制了抗體分泌細胞的生長,。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”,，可能是防止抗體停止分泌的有效措施,。

三要：

要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細胞的生長狀況,。

要定期進行再克隆,。

三不要：

不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優(yōu)勢,，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月,。

不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代,。

4、雜交瘤細胞難以克隆化

可能與小牛血清質(zhì)量,、雜交瘤細胞的活性狀態(tài)有關(guān),，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功,。若是融合后的早期克隆化,，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。