臨床ELISA測定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單,，一般涉及

到標(biāo)本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣,、溫育、洗板,、顯色,、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面,，其中

任一步驟的不當(dāng)都會(huì)影響測定結(jié)果,，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚?，F(xiàn)分述如下：

一,、臨床標(biāo)本的收集和保存

      用于ELISA測定的臨床標(biāo)本zui為常用的是血清（漿）,，有時(shí)因?yàn)樘囟ǖ臋z測目的，也用到唾液,、腦脊

液,、尿液、糞便等標(biāo)本,。目前臨床上使用血清標(biāo)本測定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體,、腫瘤標(biāo)

志物、激素,、特種蛋白,、細(xì)胞因子和治療藥物等。對用于激素和治療藥物測定的血清標(biāo)本的收集,，要注意收

集時(shí)間甚或體位有可能會(huì)對測定結(jié)果產(chǎn)生影響,。如可的松在早晨4～6點(diǎn)之間，會(huì)有一峰值出現(xiàn)：生長激素,、

促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發(fā)性方式釋放,，因此，在測定此類激素時(shí),，有必要在密切相

連的時(shí)間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本,，以其中間值為測定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r(shí),，血清中腎素活性將出

現(xiàn)明顯增高,。再如治療藥物的檢測，應(yīng)根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)選擇服藥后的zui適時(shí)間抽血檢測,。用于傳染性病原體

的抗原和抗體,、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測的血清標(biāo)本的收集則沒有時(shí)間和體位方面的影響，只是在處

理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：

（1）要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血,。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán),，其有類似過氧化物的活性，因此,，在以HRP

為標(biāo)記酶的ELISA測定中,，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相,，從而

與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色,。

（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的生長,，其所分泌的一些酶可能會(huì)對抗原

抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用,；二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的

測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。

（3）血清標(biāo)本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周,，如為有菌操作,，則建議冰凍保存。樣本

的長時(shí)間保存,，應(yīng)在-70℃以下,。

（4）冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對標(biāo)

本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,，從而引起假陰性結(jié)果,。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意,，不要進(jìn)行劇烈振

蕩,，反復(fù)顛倒混勻即可。

（5）標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí),，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測,。

二、試劑準(zhǔn)備

      在臨床實(shí)驗(yàn)室,，對試劑準(zhǔn)備一般不太注意,，通常的做法是，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來即用,，而忽

略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問題,，其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。

因此在ELISA測定中試劑的準(zhǔn)備zui為關(guān)鍵的是,，在實(shí)驗(yàn)開始前,，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置

20分鐘以上后,，再進(jìn)行測定,，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的,，主要是為了在后面的溫育反

應(yīng)步驟中,，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度,，以滿足測定要求,。其次，目前的商品ELISA

試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)對所提供的濃縮液稀釋配制,，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)

保證質(zhì)量,。此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時(shí),，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前臨時(shí)配制,。

三、加血清樣本及反應(yīng)試劑

      在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器加入樣本的步驟,。使用

微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快,，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡,。加樣太

快,，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū),，易導(dǎo)致非特異吸附,。濺出會(huì)對鄰近孔

產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異,。試劑的加入在國產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加,，除了要注

意滴加的角度外，滴加的速度也很重要,，滴加太快,，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會(huì)

在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附,，從而引起非特異顯色,。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定

為陽性,，下次測定為陰性,，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。

四,、溫育

     溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素,。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合

反應(yīng)在固相上進(jìn)行,，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合,，必須在一定的溫度條件

下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比,，即溫度越高,，則所需時(shí)間相對較短。zui為常用的溫育溫度

有37℃和室溫,，其次是43℃和2～8℃,。

     溫育這一步是臨床ELISA測定中zui容易出現(xiàn)問題的步驟。通常目前國內(nèi)ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間

為37℃ 30分鐘～1小時(shí),，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時(shí)才能有較*的結(jié)合,，低于1小時(shí)，可

能會(huì)影響測定下限,。因此,，關(guān)于溫育,，在實(shí)際測定操作中一定要注意以下幾點(diǎn)：

      要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間。一般來說,，加完樣本和/或反應(yīng)試劑后,，將微孔板從室溫拿至

水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃,，需要一定的時(shí)間,，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)

下，這段升溫時(shí)間可能還比較長,，而在臨床實(shí)驗(yàn)室中,，很少有人注意這個(gè)問題，通常是將微孔板一放入溫箱

即開始計(jì)時(shí),，這樣就很容易造成實(shí)際測定中溫育時(shí)間不夠,，弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南方的

血站同行提出了一個(gè)問題,，就是在每一年的冬季總有那么一個(gè)多月的時(shí)間,，在做HBsAg測定的室內(nèi)質(zhì)控中，

測定由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心供應(yīng)的1 ng/ml弱陽性樣本時(shí),，總是測不出來,，不知原因?yàn)楹危窟@可能就與南方

冬天室內(nèi)溫度較低有關(guān),，此時(shí)微孔板轉(zhuǎn)入溫箱后37℃溫育時(shí)間不夠,，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此,，為

保證37℃下足夠的溫育時(shí)間,，臨床實(shí)驗(yàn)室可自行確定本實(shí)驗(yàn)室不同季節(jié)（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫

箱后需要多長時(shí)間孔內(nèi)溫度才能達(dá)到37℃，從而適當(dāng)延長板條在溫箱中的放置時(shí)間,。具體的做法是,，用一小

溫度計(jì)放置板孔反應(yīng)溶液中測量觀察即可。