結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）,，是ELISA中zui關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性,，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性,。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤诮Y(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）,。此外,，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。

酶
用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高,，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高,，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定,，來(lái)源豐富,，價(jià)格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力,。在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶,。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存,，價(jià)格低廉,，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。
　　在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosohatase, AP）,。在少數(shù)商品ELISA試劑中,，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等,。
國(guó)產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物,。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%,，分子量為44000,，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成,，是一種卟啉蛋白質(zhì),。主酶無(wú)色糖蛋白在275nm波長(zhǎng)處有zui高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),，在403nm波長(zhǎng)處有zui高吸收峰,。HRP的純度用RZ（Reinheit Zahl，德文,，意為純度數(shù)）表示,，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥7.0,。
HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外,，更有價(jià)格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點(diǎn)。值得注意的是,，在選用酶制劑時(shí),，除其純度RZ外，更應(yīng)注意酶的活力,。高純度的酶如保存不當(dāng),，活力也會(huì)降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示,，可用對(duì)底物作用后生成產(chǎn)物量的測(cè)定進(jìn)行試驗(yàn),。
　　國(guó)外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶。常用的AP有兩個(gè)來(lái)源,，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取,。不同來(lái)源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000,，酶作用的pH為8.0,；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，zui適pH為9.6,。在ELISA中,，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng),，空白值也較低，但AP價(jià)格昂貴,，制備結(jié)合物所得率也較HRP低,。

抗原和抗體
　　制備結(jié)合物時(shí)所用抗體一般 均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾,。用親和層析純的抗體,，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng),，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡,。如用F（ab）2進(jìn)行標(biāo)記，則更可避免標(biāo)本中RF的干擾,。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多,，總的要求是抗原必須是高純度的。

結(jié)合物的稀釋液
　　用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液,。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白）,，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)以抑制結(jié)合物的吸附,。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20,，0.05%的濃度較為適宜,。在間接測(cè)定抗體時(shí)，血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測(cè)定,，也可應(yīng)用這種稀釋液,。