一、污染來源

　　細胞培養(yǎng)過程中污染的來源主要有以下幾條途徑：

　　1,、不潔的動物組織標本

　　很多動物組織本該是無菌的（直接與外界相通的呼吸道和消化道,、泌尿系統(tǒng)除外），但由于取材時不小心也會有污染的機會,。組織本身含有細菌,，如取材時不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會帶菌,，造成細胞污染,。

　　2、空氣

　　空氣中含有大量的微生物,，如果操作室與外界隔離不嚴或消毒不充分下,，很容易造成污染。另外,，凈化工作臺使用過久,，濾板未定期更換或長久不更換，濾氣受塵埃堵塞,，工作時不帶口罩或外界氣流過強,，污染空氣進入操作區(qū)，也會導致污染,。春夏季南方地區(qū)多雨,，空氣濕度大，含菌量多,，工作不注意也易造成污染,。

　　3、清洗消毒

　　培養(yǎng)用物品,、材料洗刷不凈,，培養(yǎng)用液和器材滅菌不*也會引入微生物和有毒物質(zhì)。

　　4,、操作

　　來自操作者的污染主要有以下幾方面：

　?。?）器材和溶液使用前未仔細檢查是否污染過，或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過,，或者雖經(jīng)處理,，時隔已久又末重新處理。

　?。?）操作者未戴口罩,、帽子,，呼出氣中排出細菌和支原體。

　?。?）培養(yǎng)瓶口未用75%酒精擦和燒灼,。

　　（4）操作者不當心,，動作不正確而將吸管或無菌器具碰到了污染的物品,，如手上皮膚和瓶子外壁等。

　?。?）操作者操作時大聲說話,，來回走動揚起灰塵等。

　　5,、血清

　　市售血清滅菌不*,，潛在病毒和支原體污染。

　　二,、污染的鑒別

　　1,、細菌、真菌污染的檢測

　?。?）肉眼觀察細菌,、真菌污染常在傳代、換液,、加樣等開放性操作之后發(fā)生,，而且增生迅速，若有污染,，在48小時內(nèi)可明顯觀察到,。如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起,。

　?。?）鏡下觀察在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染,。若細胞之間有絲狀,、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染,。

　?。?）接種觀察采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染,。

　　2、支原體污染的檢測

　?。?）相差顯微鏡觀察將細胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的支持物（一般用長形蓋玻片）,，24小時后用清潔塵鑷子從培養(yǎng)瓶中取出支持物，細胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片,，用相差油鏡觀察,；若不用支持物培養(yǎng)法，直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上,，再蓋上蓋片觀察亦可,。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間,，有時可見類似于布朗運動的表現(xiàn),。應注意與細胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。

　?。?）低漲處理地衣紅染色觀察取已在培養(yǎng)瓶中的支持物蓋片或培養(yǎng)液,，用新鮮配制的0.5%枸椽酸溶液處理蓋片細胞。用新配制的Carnoy液固定兩次,，每次10分鐘,，取出蓋片涼干。用培養(yǎng)液時,，先吸取1mL,，500～800r/min離心5分鐘后去除上清，留0.2mL,，將0.5%枸椽酸溶液加入其中,，置10分鐘，加入Carnoy液固定,，離心棄上清固定液,，余0.2mL沉淀物，制成2～3張涂片,。然后用2%醋酸依地紅（地衣紅2g,，冰醋酸60mL，加蒸餾水至100mL）染5分鐘,。純酒精過三次,，每次1分鐘，封入Euparal或樹膠中,。若染色過深,，可先用75%酒精脫色，再封片,。鏡下觀察見支原體呈暗紫色小點,，位于細胞外或細胞之間。

　?。?）熒光染色法觀察用熒光染料Hoechst33258,，此染料能與DNA特異地結合,，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察,。染色方法為：用支持物蓋片培養(yǎng)法將細胞接種在蓋片上,，在細胞匯合前（即未長滿前）取出玻片，于碟皿中,，用不含酚紅的Hanks液漂洗,，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258（生理鹽水配制）中染色10分鐘,，置于蒸餾水漂洗1～2分鐘,，向細胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察,。若用細胞培養(yǎng)液,，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗,，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘,，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分鐘,，加入蒸餾水漂洗,，離心去上清蒸餾水，加3～5滴pH5.5磷酸緩沖液,，稍吹打使沉淀細胞重懸浮,，用吸管吸出，滴于載物片上,，蓋上蓋片后觀察,。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面,。

　?。?）電鏡檢測若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察,。一般在細胞培養(yǎng)48～72小時,，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行,。需經(jīng)過固定,、包埋、切片后才能進行觀察,。詳細方法同細胞形態(tài)觀察法（見第九章）,。

　　（5）培養(yǎng)檢測將2.5×109/L細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基（Sigma或北京生物制品所生產(chǎn)的均可）,，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀,，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中,，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn),。細胞培養(yǎng)污染