一 原理：
    IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法,。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后,，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的,。
    實(shí)驗(yàn)zui需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì),?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同,，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說明書,。特別是多抗的特異性是問題,。
    其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì),。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白,，緩沖液必須要使其溶解,。為此，必須使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液,，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合,。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞,，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白,。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉,，影響與抗體的結(jié)合,，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果,。
    再次,，為防止蛋白的分解,，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑,，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
    每次實(shí)驗(yàn)之前,，首先考慮抗體/緩沖液的比例,。抗體過少就不能檢出抗原,，過多則就不能沉降在beads上,，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋,。欲速則不達(dá),，確定好比例很必要。（待續(xù)）
    二 準(zhǔn)備：
    器械：    微量高速冷凍離心機(jī)    移液槍    旋轉(zhuǎn)盤    電泳設(shè)備    vortex震蕩器
    液氮及組織粉碎器    eppentube
    試劑：    細(xì)胞或組織    蛋白定量kit    SDS電泳試劑    抗體（單抗時(shí)選擇protein G,二抗選擇抗鼠Ig兔血清）    PBS    NaN3    proteinA sapharose
    試劑配制
    抗原蛋白溶解緩沖液
    1.RIPA緩沖液 （zui終濃度）
    1MTris-HCL（PH7.4） 5ml （10mM）
    5MNacl 15ml （150mM）
    0.5M EDTA（PH7.4） 5ml （5mM）
    20%TritonX-100 25ml （1%）
    10% DOC 50ml （1%）
    10%SDS 5ml （ o.1%）
    TLCK 18.5mg （0.1mM）
    TPCK 35mg （0.2mM）
    DDW 395ml
    toal 500ml
    另外,，使用之前加1mMPMSF（PMSF溶在酒精,，濃度100mM，-20度遮光保存,。注意不易溶于水）
    2.NP40 lysis 緩沖液
    1MTris-HCL（PH7.4） 5ml （10mM）
    5MNacl 15ml （150mM）
    0.5M EDTA（PH7.4） 5ml （5mM）
    20%NP40 25ml （1%）
    TLCK 18.5mg （0.1mM）
    TPCK 35mg （0.2mM）
    DDW 450ml
    toal 500ml
    使用前加1mM的PMSF
    注意點(diǎn)：
    *Tris緩沖劑PH隨溫度變化,，高濃度鹽酸滴定時(shí)發(fā)熱，冷卻后PH增高,。
    *反復(fù)使用PMSF要注意保管方法,。
    *1和2的緩沖劑的區(qū)別在于界面活性劑。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑,，作用溫和,，，DOC
*兩方都有EDTA,，對抗原而言,，二價(jià)離子Mg,Ca等是必要的。根據(jù)自己需要調(diào)節(jié),。EDTA用NaOH滴定,。

    Protocol
    1. 調(diào)制protein A sapharose
    protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
    離心2000轉(zhuǎn)2分，去上清,，在沉淀加0.02%NaN3的PBS,，離心后去上清，重復(fù)2次,，zui后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,，冷藏保存
    用單抗做一抗時(shí)，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清處理（每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清）,。旋轉(zhuǎn)1-2h,混勻后,，再離心1-2s去上清后，加PBS,，vortex混合,，離心去上清，重復(fù)二次加含0.02%NaN3的PBS到原來體積,，冷存,。避免長期保存。
    2．抗原的檢出
    以下操作全在冰面或4度進(jìn)行去除細(xì)胞培養(yǎng)液,，用冷PBS洗一次,。加RIPA,，溶解后，轉(zhuǎn)移到eppentube中用vortex混勻,。RIPA的量：6cm的培養(yǎng)皿加1 ml（蛋白質(zhì)的量為500mg/ml）,組織塊用液氮粉碎,，在緩沖劑中搗勻，蛋白定量,。
    30m,，15000rpm離心，上清轉(zhuǎn)移到新tube ,。不用移液槍,，直接從tube倒進(jìn)另一個(gè)tube
往上清加抗體，1ml加2-5ul抗體,，冷室內(nèi)旋轉(zhuǎn)混勻1h加protein A sapharose50ul,，再混勻1h5000rpm離心1s,使sapharose沉淀，去上清,。往sapharose加RIPA,，vortex 混勻，離心,，去上清,。重復(fù)4次洗凈。
    加電泳用 sample 緩沖液40ul,2m煮沸,，泳動(dòng)后,，固定/干燥膠,，現(xiàn)像,。
    3.注意點(diǎn)
    A：不熟練使用移液槍，會混入沉淀的不溶性蛋白,，使實(shí)驗(yàn)失敗,。對無論怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部,，或用超速離心機(jī),。
    B：對電泳的非特異條帶，zui后可依次用含300mM,，1omMNaCl的RIPA洗凈各一次,。（完）