準備工作：
    預冷PBS,，RIPA Buffer,，細胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下）,，離心機
    1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次,，zui后一次吸干PBS；
    2. 加入預冷的RIPA Buffer（1ml/107個細胞,、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶,，0.5ml/5×106個細胞、6cm培養(yǎng)皿,、75cm2培養(yǎng)瓶）
    3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下,，把懸液轉到1.5EP管中，4℃,，緩慢晃動15min（EP管插冰上,，置水平搖床上）
    4. 4℃，14000g離心15min,，立即將上清轉移到一個新的離心管中
    5. 準備Protein A agarose,，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度,，建議減掉槍尖部分,，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
    6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上,，置水平搖床上）,，以去除非特異性雜蛋白，降低背景
    7. 4℃,，14000g離心15min，將上清轉移到一個新的離心管中,，去除Protein A珠子
    8. （Bradford 法）做蛋白標準曲線,，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上,，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量,，分裝后，可以在-20℃保存一個月）
    9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl,，以降低裂解液中去垢劑的濃度,，如果興趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高（如10 μg/μl）
    10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異
    11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h,，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育
    12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物,，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗,，建議加2 μl“過渡抗體”（兔抗鼠IgG,，兔抗雞IgG）
    13. 14000rpm瞬時離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物,，去上清,，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍,，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合,，可以使用PBS
    14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻,，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）
    15. 將上樣樣品煮5min,，以游離抗原，抗體,，珠子,，離心，將上清電泳,，收集剩余瓊脂糖珠,，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳,，電泳前應再次煮5min變性,。
    RIPA Buffer配制：
    基礎成分：
    Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性）
    NaCl（鹽份,，防止非特異蛋白聚集）
    NP-40（非離子去污劑,，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液）
    去氧膽酸鈉（離子去污劑,，提取蛋白,；用H2O配制成10%儲存液；避光保存）
    注意：準備激酶（致活酶）實驗時,，不要加去氧膽酸鈉,，因為離子型去污劑能夠使酶變性，導致活性喪失,。
    RIPA蛋白酶抑制劑
    苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200mM的儲存液,，室溫保存）
    EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲存液,，PH 7.4）
    亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的儲存液,，分裝,，-20℃保存）
    抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝,，-20℃保存）
    胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的儲存液,，分裝，-20℃保存）
    RIPA磷酸（酯）酶抑制劑
    激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的儲存液,，見Sodium Orthovanadate Activation Protoco）
    NaF（200mM的儲存液,，室溫保存）
    注意：在準備做磷酸（酯）酶實驗的時候，不加磷酸酯酶抑制劑
    工作液配制：
    配制100ml的modified RIPA buffe：
    1. 稱取790mg 的Tris-Base,，加到75ml 去離子水中,，加入900mg的NaCl，攪拌,，直到全部溶解,，用HCl調節(jié)PH值到7.4
    2. 加10 ml 10%的NP-40
    3. 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌,，直到溶液澄清
    4. 加1 ml 100mM的EDTA,，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
    5. 理論上,，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時加入（抑蛋白酶肽,，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl），但是PMSF在水溶液中很不穩(wěn)定,，30分鐘就會降解一半,，所以PMSF應該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5天,。
    各種成分在工作液中的終濃度：
    • Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
    • NP-40: 1%
    • 去氧膽酸鈉：0.25%
    • NaCl: 150 mM
    • EDTA: 1 mM
    • PMSF: 1 mM
    • 抑蛋白酶肽,，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑: 各1 µg/ml
    • Na3VO4: 1 mM
    • NaF: 1 mM
    通過免疫共沉淀確定結合蛋白
    1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中,。
    2．將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中,，在微量離心機上4℃以zui大速度離心15 min。
    3．收集上清（約30 ml）并加入30μg的適當抗體,，4℃搖動免疫沉淀物1 h,。
    4．加入0.9 ml的蛋白質A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min,。
    5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,，再重復洗5次。zui后,，用NETN洗一次。
    6．吸出混合物的液體部分,。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中,，煮沸4 min。
    7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過夜,。
    8．通過考馬斯藍染色觀察蛋白質泳帶,。
    9．從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中,，用1ml 50%乙腈洗兩次,，每次3 min。
    10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質,，再將肽電洗脫,。
    11． 通過窄孔液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序,。