兔TNF-α ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清,、血漿,、組織、緩沖液中細胞上清液及各種體液中的TNF-α ,。本試劑盒可以檢測天然和重組的TNF-α ,。本試劑盒于科研、而非用于臨床診斷,。

 

兔TNF-α 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知TNF-α 濃度的標準品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將TNF-α 和生物素標記的抗體同時溫育,。洗滌后,，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,，然后加入底物A、B,，和酶結(jié)合物同時作用,。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TNF-α 的濃度呈比例關系,。

 

 

1． 蒸餾水,。

2． 加樣器：5ul、10 ul,、50 ul,、100 ul、200,、500 u,、1000lul。

3． 振蕩器及磁力攪拌器等,。

 

1． 避免直接接觸終止液和底物A,、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗,。

2． 實驗中不要吃喝,、抽煙或使用化妝品。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。

 

 

 

1． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫,。稀稀過后的標準品應丟棄,，不可保存。

2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,，密封保存,，以免變質(zhì)。

3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用。

4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染,，吸取終止液和底物A,、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器,。

5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6． 洗滌酶標板時應充分拍干,，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水,。

7． 底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感,，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,，有毒,。實驗完成后應立即讀取OD值。

8． 加入試劑的順序應一致,，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣,。

9． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作,。

 

1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激,。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2,、 血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測,。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。

3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4,、 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存,，避免反復冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,，檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

 

1． 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備,，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻,。稀釋比例按下表中進行：

 

2． 洗滌緩沖液（20×）的稀釋：蒸餾水20倍稀釋,。

 

1． 使用前,，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,，以免加樣時加入大量的氣泡,，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個標準品和空白孔建議做復孔,。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔,。

3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔,、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體,。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時,。

4． 甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次,。

5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育30分鐘,。

6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次,。

7． 每孔加入底物A、B各50ul,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育10分鐘。避免光照,。

8． 取出酶標板,，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結(jié)果,。

9． 在450nm波長處測定各孔的OD值,。

 

 

以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的TNF-α 標準品濃度為橫坐標（X）,，做得相應的曲線,，樣品的TNF-α 含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

 

6號標準品以上的結(jié)果為非線性的,，根據(jù)此標準曲線無法得到的結(jié)果,。

 

1． 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990,。

2． 特異性：不與人其它細胞因子反應。

3． 重復性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于10%,。