【摘要】：影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,，如盒特異性、檢驗(yàn)標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物,，操作過程中的問題,。本文就這一原因作一簡(jiǎn)要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度，從而提高檢測(cè)的特異性,，并得到更準(zhǔn)確,、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【關(guān)鍵詞】 ELISA 非特異性 顯色
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）自1971年自問世以來,，以其敏感性高,，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便,、安全,，而廣泛應(yīng)用于臨床診斷，開創(chuàng)了免疫學(xué)診斷的新紀(jì)元,。但同其它免疫診斷方法一樣酶免在它的研究,、生產(chǎn)及使用中常常會(huì)碰到非特異性問題，本文就在實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的一些原因及如何采取一些措施,，消除非特異性顯色作一分析,。
1、盒特異性因素
1,、1 固相載體的選擇,。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,，以微量滴定板zui為常見[1],。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高,，空白值低,，各板之間,、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,。因此，在選擇盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證,，評(píng)估,。
1、2包被物的純度,。在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中,，的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制,，包被用抗原或的純度不可能達(dá)到100%,，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度,，提高特異性,。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
1,、3包被的效價(jià),。具有高親和力和高特異性的包被，是決定特異性的重要方面,。
1、4 封閉,。是ELISA中重要的一步,，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2]，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾,。
2,、檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2、1內(nèi)源性干擾物：類風(fēng)濕因子（RF）,、黃疸等,，類風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體，多數(shù)為IgM類,，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),，從而呈現(xiàn)非特異性顯色。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶,，如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物,，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。
2,、2 外源性干擾物,，常常因樣品采集,、貯存、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,，被細(xì)菌污染,，標(biāo)本凝集不全等。溶血標(biāo)本,，紅細(xì)胞溶解破裂,，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過氧化酶）[2],，有國(guó)內(nèi)報(bào)道酶免HBsAg檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久,，其中的IgG可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此,，血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心,，在冰箱中保存不易過久。
標(biāo)本凝集不全時(shí),，血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原,，也易造成假陽性。
3,、操作過程中的問題造成假陽性
3,、1加樣
對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋，如果加樣不準(zhǔn)就會(huì)造成誤差,，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí),，很小的誤差，會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差,，使陰性（或弱陽性）標(biāo)本呈陽性（或陰性）,。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡。目前,，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本,，可較好地避免以上誤差。
3,、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步,，應(yīng)引起操作者重視,。無論是手工操作還是機(jī)器操作，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),，ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。
3,、3 溫育
每種都有其*反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素,。因孵育溫度高,，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)造成整板本底高,，陽性率高,。溫育一般用濕盒或水浴，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板溫度都能迅速平衡,，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋,。
3,、4酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,，決定結(jié)果的可靠度,。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對(duì)濾光片要定期校正,；其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確,，使用雙波長(zhǎng)，一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng),，一個(gè)參比波長(zhǎng)，以消除微孔板底部劃痕,、不平,、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外,，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)先擦試微孔板底部并壓平板條,。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書
綜上所述,，由于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上缺乏標(biāo)準(zhǔn)化,，盡管目前上以及我國(guó)有了部分標(biāo)準(zhǔn)血清或參比血清（血清盤）。但由于受方法學(xué)及技術(shù)條件的限制,，在酶聯(lián)吸附測(cè)定中有時(shí)不可避免的會(huì)出現(xiàn)一定的非特異性,，但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底,，從而提高檢測(cè)的特異性，并得到更準(zhǔn)確,、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。