原理：
抗血清為含有某一類具有特異免疫功能的抗體分子的血清,，一般為動物被人工注射某類抗原后制備的動物血清,。價的抗血清用于研究工作以及疾病的診斷和治療,。
一種抗原能否引起抗體生成反應,，一方面取決于抗原分子表面有無抗原決定簇（Antigenic
determinant）,，另一方面取決于機體的免疫狀態(tài)，當具備以上兩個條件后,，抗體生成將遵循抗體生成的一般規(guī)律——初次反應和再次反應,。
抗原的種類繁多，包括天然的蛋白質抗原和細胞性抗原,、合成性抗原以及基因工程抗原等,，不同的抗原免疫動物具有不同的特殊性。一般*抗原免疫動物需加用佐劑,，尤其在使用可溶性抗原時,，以期得到價的抗血清；合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物質需先通過人工的方法與蛋白質載體連接后再與佐劑混合免疫動物,，方可獲得理想的免疫效果,。使用佐劑后可增加抗原的免疫原性和延長抗原在機體內(nèi)存留的時間，從而改變了抗原原有的免疫原性,。

材料：
1,、金屬編號牌（對動物作標記錄）或染料,；
2、1毫升,，5毫升,、20毫升注射器；
3,、采血針頭（9#,，12#），卡價苗針頭（41/2 # — 51/2 #）,；
4,、滅菌平皿，疫苗瓶,，青霉素瓶，皮塞以及吸管,，脫脂棉,；
5、卡介苗（75mg/ml）,；
6,、抗原（小鼠血清）；
7,、青霉素溶液,，鏈霉素溶液和5%葡萄糖溶液；
8,、液體石臘（醫(yī)用）,，羊毛臘（配制佐劑用）；
9,、滅菌生理鹽水,，消毒用酒精，2.5%碘酒,；
10,、1.5%瓊脂，玻板,，飯盒（保濕,、保濕作用）；
11,、實驗動物（家兔）,。

步驟
1、動物的選擇
羊,、馬,、雞,、猴、豚鼠,、兔都是常用的免疫動物,，在實驗中，選擇動物時應考慮抗原與動物的種屬關系,、抗原性質與動物種類,、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及動物個體等因素,。免疫用動物應選適齡,、健壯．為雄性。zui常用的實驗動物是家兔,，一般選擇選擇年齡在6個月以上當年繁殖的♂性,，體重2 ～3公斤，健康家兔三只,，免疫前用金屬編號牌固定兔耳,，或用染料涂沫在動物的背部，作出明確的標記,。
2,、抗原制備
1）抗原稀釋：用滅菌生理鹽水將抗原稀釋為2mg/ml，于免疫前一天加入青霉素溶液,，使每毫升抗原溶液含青霉素1000 UI,，鏈霉素1000
UI，放4℃過夜（一般可不加青,、鏈霉素）次日取出,，與佐劑混合制成乳劑后用于動物免疫。
免疫原的注射劑量應考慮其抗原性的強弱,、分子量大小,、動物的個體狀態(tài)和免疫時間。對于純的可溶性抗原的免疫劑量,，通常小鼠抗原劑量為50～100μg/次,，大鼠為100～200μg/次，兔為100μg ～1 mg/次,，合成免疫原為2
mg（半抗原約為20～200μg）,，一般需要與等量的福氏*佐劑混合。加強免疫的劑量為計量的1/2,，通常用不*福氏佐劑或不用佐劑,。如需制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫法,；反之,，欲獲得價的抗血清,，宜采用大劑量抗原長程免疫法。
2）佐劑和抗原乳劑的配制
1佐劑的配制：福氏*佐劑（Freund’s complete adjuvant）,，各實驗室的配方不盡相同,，我室采用的配方如下：
醫(yī)用液體石臘 20毫升
羊毛脂 12克
水浴溶化、混勻,，分裝于青霉素小瓶,，用紗布、線繩扎緊瓶塞,。8磅20分鐘滅菌,，4℃保存?zhèn)溆谩Ｓ诿庖咔皽蕚淇乖閯┲苽鋾r,，以活卡介苗（有時亦用死卡介苗）代替死結核菌,，每毫升試劑中加入10mg活卡，即為福氏*佐劑,。
2抗原乳劑的制備：其方法一般有兩種,，其一，將等量的*佐劑（注意佐劑必須預先加熱融化,，但不超過50℃）和抗原溶液分別吸入兩個5ml注射器內(nèi)，在兩個注射器的12#
針頭間套上一根長約8～12cm的醫(yī)用無毒塑料管,，將兩個注射器連接在一起（塑料管必須先經(jīng)酒精浸泡消毒,，使用時取出，用滅菌生理鹽水沖洗后,，與注射器針頭相連接,，塑料管與針頭的口徑須合適，不能松,，稍緊些為宜）,，針頭插進塑料管約1～2cm然后由兩人相對而坐后緩緩推動針蕊，使管內(nèi)溶液進入塑料管道至對側注射器內(nèi),，每次推動針蕊時必須把管內(nèi)容物全部推出,，另一側也同樣操作，使管內(nèi)液體往返混合,，直至形成油包水乳劑（Water-in-oil enulsion）為止,。
其二是，將等量的佐劑和抗原溶液倒入缽內(nèi),，經(jīng)過反復碾磨,，也可形成油包水乳劑，該法主要優(yōu)點是快速,，可靠,，不足方面主要是由于粘附過多,，浪費佐劑及抗原。
制成的乳劑是否形成油包水乳劑直接影響免疫效果,，因此,，必須進行質量檢查，檢查的方法是將制成的乳劑滴一滴在涼水（自來水）表面,，質量合格的乳劑滴入水面保持滴珠完整而不分散,，不合格者進入水面后立即擴散，水面油亦逐漸擴大,，這就必須要繼續(xù)操作至質量合格為止,。
但有時，由于佐劑的配制質量原因,，很難乳化至合格,，遇有這種情況，須考慮重新配制佐劑,。
3,、免疫途徑，劑量和免疫周期
抗原注射途徑可根據(jù)不同抗原及試驗要求,，選用皮內(nèi),、皮下、肌肉,、靜脈或淋巴結內(nèi)等不同途徑注入抗原進行免疫,。一般常采用背部、足掌,、淋巴結周圍,、耳后等處皮內(nèi)或皮下多點注射。初次免疫與第二次免疫的間隔時間多為2～4周,。常規(guī)免疫方案為抗原加CFA皮下多點注射進行基礎免疫,；再以免疫原加IFA作2～5次加強免疫，每次間隔2～3周,，皮下或腹腔注射加強免疫,。
1）常規(guī)（皮內(nèi)多點注射）免疫：
1*次免疫：劑量為每只兔子注射1.0 ml抗原乳劑（含抗原量1～2mg）。注射部位為兩只后腳掌的皮內(nèi)各注射0.2 ml,，其余0.6
ml分多點注入脊柱二側,，頸部，腹股溝和腋窩等處淋巴結附近部位皮內(nèi),，每點可注入0.05ml,，分12點注入。
2第二次免疫：初次免疫后20天左右，劑量為1.0ml/只（1～2 mg/ml）,，加福氏不*佐劑,。注射部位在腹部皮下多點注射，每點注入0.1 ml,。
3第三次免疫：再次免疫后兩周內(nèi)進行,，注射劑量和部位同第二次免疫，免疫后7～14d抽取少許靜脈血,，分離血清,，試血測定效價。
2）淋巴結免疫：主要優(yōu)點是可減少抗原用量,。過程如下：
1卡價苗致敏：免疫前足掌皮下每側各注入活卡價苗（75 mg/ml）0.3 ml,。10天左右觀察兩側腘窩淋巴結，一般可腫脹如蠶豆大小,，此時即可進行淋巴結內(nèi)免疫注射,。
2*次免疫：用手淋巴結后在兩側腘窩淋巴結內(nèi)各注入抗原乳劑0.25ml，每只兔總量0.5 ml,；為加強免疫,，于初次免疫20天后，于腹部皮下多點注射不加佐劑抗原溶液1mg/1ml,。
3二周后可如同*次免疫的劑量和途徑再注射一次,，一般可在第三次免疫注射前試血滴定效價，效價如已達到要求可不必進行第三次免疫,。
有條件的情況下,，免疫后要加強動物飼料管理，如給熟黃豆飼養(yǎng)等,。
3）腹腔免疫：一般不必加佐劑，適用于細胞性或顆粒性抗原,，而且抗原性較強者,，例如用綿羊紅細胞免疫家兔或小鼠即可用此法。
4,、試血,，測定抗體效價
一般在第三次免疫后7～10天即可于兔耳靜脈或小鼠尾尖取少量血，分離出血清之后進行試血,。
① 環(huán)狀試驗,，較為經(jīng)典的方法，目前較少采用,，如與20μg/ml以下的抗原于30 min內(nèi)能出現(xiàn)“艸”的沉淀環(huán),，即測定抗體效價達1：5000以上時為合格。
② 免疫雙擴散法,，這是zui常用的試血方法,，其具體方法是,，中間孔加稀釋的抗原（1mg/ml）10μl，周圍孔順時針方向加制備的抗血清分別為1:2, 1:4,
1:8,，1:16,，1:32和1:64，（用生理鹽水或PBS稀釋）,。經(jīng)37℃保溫24h后觀察結果,，效價在1:16以上即可決定放血。
5,、放血
經(jīng)效價檢查合格后即可放血,。放血前動物應停食12 h，以減少血清中的脂肪含量,。如擬保留該免疫動物,，可直接由心臟取血，或切開耳緣靜脈滴血或心臟穿刺取血,。取血后由靜脈緩緩注入等量5%葡萄溶液以補足失血量,。取血的動物經(jīng)2～3個月休息，可再次加強免疫后取血,。如擬一次放血致死,，可用頸動脈放血的方法，各種取血方法如下,。
1）心臟取血：固定動物于仰臥位置,，用食指探明心臟博動量高部位（在胸骨左側，由下向上數(shù)第3與第4助骨之間,，指兔）,，剪去少許毛，用2.5%
碘酒和75%酒精消毒后,，以9#針頭在預定位置與胸部呈45,。角刺入心臟，微微上下移動針頭,，待見血液進入針筒后,，即將注射器位置固定取血。2.5公斤體重的家兔一次可取血20～30ml,。
2）耳緣靜脈滴血：先將耳緣靜脈附近的毛剪去用無菌棉球將皮膚擦干凈（不用酒精消毒,，避免溶血）。用臺燈照射耳部使血管因溫度增高而擴張,，然后用無菌刀片將耳緣靜脈切一長0.5cm的縱切口,，*次切口應從耳尖部開始，以后再切時，逐步向耳根方向移動,。用無菌試管或平皿收集流出的血液,。如切口凝血，血流不暢時,，可用無菌棉棒輕輕將切口外血凝塊擦去（注意勿使切口損傷太大）,，血流仍可繼續(xù)流出，直至達到所需要的血量為止,。取血后用無菌棉球壓迫切口止血,。耳緣靜脈取血一次可取血50ml左右而動物不死。
3）頸動脈放血：使動物仰臥固定四肢,，頸部剪毛,、消毒后縱向切開前頸部皮膚長約10cm，用止血鉗將皮膚分開夾住,，剝離皮下組織,，露出肌層，用刀柄加以分離,，即見搏動的頸動脈,。小心將頸動脈和迷走神經(jīng)剝離長約5cm，選擇血管中段,，用止血鉗夾住血管壁周圍的筋膜,。遠心端用絲線結扎，近心端用動脈鉗夾住,，用酒精棉花球消毒血管周圍,，用無菌剪刀剪一V形缺口。取長2.5cm,、直徑為1.6mm塑料管一段,，將一端剪成針頭樣斜面，并將此端插入頸動脈中,，另一端放入200ml無菌三角瓶內(nèi),，然后放開止血鉗，血即流入三角瓶內(nèi),，動物流血至死,，2.5公斤家兔可放血80～100ml,。
6,、分離血清
必須在無菌條件下進行，待收集于平皿或三角瓶內(nèi)的血液凝固之后,，用無菌滴管在無菌環(huán)境（例如超凈工作臺）中把血塊與瓶壁剝離后,，放入37℃，1～2h取出后放入4℃過夜，使血清充分析出（不能冰凍,，否則產(chǎn)生溶血）,，經(jīng)離心沉淀分出血清，放進低溫冰箱保存,。使用前必須經(jīng)過簽定合格后再分裝保存?zhèn)溆谩?br />7,、抗血清的保存
1）經(jīng)簽定合格后的抗血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的疊氮鈉,，使其zui后濃度分別為0.01%或0.05%,。
2）用無菌滴管將抗血清分裝小管，每管裝1ml左右,。
3）-20℃以下保存,，可保存2年以上。
4）如有條件可將血清冷凍干燥保存于4℃以下,，保存時間更久

注意事項
1,、動物的免疫反應存在著個體差異，甚至有人報告不同品種動物一次免疫后產(chǎn)生的抗體的差別可高達500倍,，所以制備抗血清時不能只免疫一只動物,，一般免疫3～4只，因為有的動物可能產(chǎn)生抗體效價很低或不產(chǎn)生抗體,，免疫反應好的動物所能提供的抗體往往高于一般動物3～4倍,。
2、制成的抗原乳劑是否為油包水乳劑應進行檢查,，否則會影響免疫效果,，如不是油包水乳劑，應重新制備,。
3,、要制備價的抗體，必須要加佐劑（一般采用*福氏佐劑）,，加佐劑后免疫動物,，抗體效價至少可增加5倍。但也應考慮到,，如果抗原中有微量的雜蛋白存在,，即使0.005mg，亦可因有佐劑而產(chǎn)生非特異性的抗體,，所以要根據(jù)實驗需要和抗原的純度適當?shù)厥褂米魟?br />4,、分裝保存的抗血清應注明抗血清的名稱，效價,，制備日期以及包裝量,。
5,、當抗原量過少不易提純時，可采用抗原抗體在瓊脂擴散中形成的沉淀線直接免疫動物制備抗體,。
6,、抗血清效價一般以抗血清稀釋倍數(shù)表示。血清效價的檢測方法很多,，靈敏度各不同,，因此在表示抗血清效價時，應標明檢測方法,。另外,，在沉淀反應中，出現(xiàn)沉淀時的抗原,、抗體比例有一較大的范圍,，如用不同濃度的抗原測定效價時，結果會因此有別,，所以在測定抗血清效價時,，需注意抗原的濃度。
7,、為制備單價特異性高的抗血清,，所用抗原純度越高越好，因此,，在純化抗原過程中應盡量除去可能存在的雜蛋白,，這樣可以省去許多時間來吸收抗血清中的非特異性抗體。




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