原位雜交
基本定義
將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交,，稱為原位雜交！使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細菌或其他真核細胞中的位置,。

RNA原位雜交
1,、RNA原位核酸雜交又稱RNA組織化學或RNA。該技術是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內(nèi)RNA表達的一種技術,。
2,、基本原理是：在細胞或組織結構保持不變的條件下,，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則,，與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合（雜交）,，所形成的雜交體（Hybrids）經(jīng)顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內(nèi)相應的mRNA、rRNA和tRNA分子,。RNA技術經(jīng)不斷改進,，其應用的領域已遠超出DNA技術。尤其在基因分析和診斷方面能作定性,、定位和定量分析,，已成為zui有效的分子病理學技術，同時在分析低豐度和罕見的mRNA表達方面已展示了分子生物學的一重要方向,。

FISH
FISH是技術大家族中的一員,，因其所用探針被熒光物質(zhì)標記（間接或直接）而得名，該方法在80年代末被發(fā)明,，現(xiàn)已從實驗室逐步進入臨床診斷領域,。
基本原理是熒光標記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火溫度下復性；通過熒光顯微鏡觀察熒光信號可在不改變被分析對象（即維持其原位）的前提下對靶核酸進行分析,。DNA熒光標記探針是其中zui常用的一類核酸探針,。利用此探針可對組織、細胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平的分析,。熒光標記探針不對環(huán)境構成污染,，靈敏度能得到保障，可進行多色觀察分析,，因而可同時使用多個探針,，縮短因單個探針分開使用導致的周期過程和技術障礙。

例子
　　以菌落為例：
　　對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進行克隆篩選時,，可采用本方法,。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后,，對菌落進行原位裂解,。主平板應貯存于4℃直至得到篩選結果。
1. 將少數(shù)菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上
　?。?） 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜,。
　　（2） 用無菌牙簽將各個菌落先轉移至濾膜上,再轉移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上,。應按一定的格子進行劃線接種（或打點）,。每菌落應分別劃線于兩個平板的相同位置上。zui后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒（如pBR322）的菌落,。
　?。?） 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
　?。?） 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個以上的不對稱位置作標記,。在主平板大致相同的位置上也作上標記。
　?。?） 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應的結果。
　?。?） 裂解細菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結合于硝酸纖維素濾膜,。

2. 菌落的裂解及DNA結合于硝酸纖維素濾膜
　　（1） 在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/L NaOH的小洼（0.75ml）,使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留于原處2-3分鐘,。
　?。?） 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復步驟（1）。
　?。?） 吸干濾膜,將濾膜轉移到新的帶有1mol/L Tris·Cl（pH7.4）的保鮮膜洼上,。5分鐘后吸干濾膜, 再重復一次該步驟。
　?。?） 吸干濾膜,把它轉移到有1.5mol/L NaCl,、0.5mol/L Tris·Cl （pH7.4）的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
　?。?） 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時,固定DNA,。
　　（6） 將固定在膜上的DNA與32 P標記的RNA進行雜交,。
3.雜交　
（1） 盛有2×SSC的塑料盤同,，將干烤的濾膜飄浮在液面上,*浸濕5分鐘。
　?。?） 將濾膜轉到200ml預洗液的玻璃皿中,。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉平臺上,。于50℃處理30分鐘,。在這一步及以后的所有步驟中,應緩緩搖動濾膜,防止它們粘在一起。
　?。?） 用泡過預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度,。
　　（4） 將濾膜轉到盛有150ml預雜交液的玻璃中,在適宜溫度（即在水溶液中雜交時用68℃,，而在50%甲酰胺中雜交時用42℃）下,預雜交1-2小時,。
　　（5） 將32 P標記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性,。將探針加到雜交袋中雜交過夜,。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴,，以防液體蒸發(fā),。
　　（6） 雜交結束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘,，并將濾膜至少翻轉一次,。重復洗一次，同時應避免膜干涸,。
　?。?）68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影,。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘,。
　　（8） 把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜（編號面朝上）放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個不對稱的標記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對應,。
　?。?） 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時,。
　?。?0） 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標記陽性雜交信號的位置,同時在不對稱分布點的位置上作出標記,?？蓮牡灼先∠峦该骷?通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。

的應用
　?、偌毎禺愋詍RNA轉錄的定位,可用于基因圖譜,，基因表達和基因組進化的研究；
　?、诟腥窘M織中病毒DNA/RNA的檢測和定位,，如EB病毒mRNA、人類乳頭狀瘤病毒和巨細胞病毒DNA的檢測,；
　?、郯┗颉⒁职┗蚣案鞣N功能基因在轉錄水平的表達及其變化的檢測,；
　?、芑蛟谌旧w上的定位；
　?、輽z測染色體的變化,，如染色體數(shù)量異常和染色體易位等,；
　　⑥分裂間期細胞遺傳學的研究,，如遺傳病的產(chǎn)前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定,，某些腫瘤的診斷和生物學劑量測定等。

的意義
　?。涸谘芯緿NA分子復制原理的基礎上發(fā)展起來的一種技術,。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下,，能過氫鍵結合,，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA 雙鍵分子的特點,，應用帶有標記的（有放射性同位素,，如3H、35S,、32P、熒光素生物素,、地高辛等非放射性物質(zhì)）DNA或RNA片段作為核酸探針,，與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸（RNA或DNA）片段進行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示,，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA 的存在并定位,；用技術，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達,。此方法有很高的敏感性和特異性,，可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調(diào)節(jié)機制。已成為當今細胞生物學,、分子生物學研究的重要手段,。