在小鼠ELISA試劑盒中一般有3次加樣步聚,，即加標(biāo)本,，加酶結(jié)合物，加底物,。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。

加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣（一般不建議使用）,。有些指標(biāo)檢測（如間接法ELISA試劑盒）需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,，再在其中加入血清標(biāo)本,，然后在微型震蕩器上震蕩1min。加酶結(jié)合物工作液和底物工作液時可用多道移液器,，使加液過程在zui短時間內(nèi)完成。

溫育常采用的溫度有43℃,、37℃,、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELISA試劑盒方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時,，產(chǎn)物的生成可達,。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度,，有些試驗在43℃進行,，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*,，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成zui多的沉淀,。但因所需時間太長,，在ELISA試劑盒中一般不予采用。

保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,，一般均采用水浴,，可將小鼠ELISA試劑盒板置于水浴箱中,，ELISA試劑盒板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡,。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上,。若用保溫箱，ELISA試劑盒板應(yīng)放在濕盒內(nèi),，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA試劑盒板放在濕紗布上,。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。為避免酶標(biāo)板底部受水汽或磨損導(dǎo)致的讀數(shù)誤差,，一般采用鼓風(fēng)恒溫箱保溫,，這個過程必須在酶標(biāo)板上方貼封紙，以免蒸發(fā),。無論是水浴還是濕盒溫育,，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。室溫溫育的反應(yīng),，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃,，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育,。室溫溫育時，ELISA試劑盒板只要平置于操作臺上即可,。溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確,。

小鼠ELISA試劑盒屬固相免疫測定，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會,，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點,。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒反應(yīng)總是需要一定時間的溫育,。