哺乳動物細胞的RNAi技術策略
目前RNAi技術已經(jīng)進入了生物科學研究的許多領域，成為了一種主要的生物學研究工具,，發(fā)展得相當迅速，并受到了此次諾貝爾獎評審委員會的青睞，獲得2006年諾貝爾獎醫(yī)學/生理獎。然而這一才歷經(jīng)十個年頭的技術依然對于許多研究人員來說還是很陌生的,，以下是有關RNAi技術在哺乳動物細胞中應用的具體設計策略，主要來自于《遺傳》雜志2005年“RNA干涉（RNAi）技術應用于哺乳動物細胞的研究策略”,，希望能給從事或者準備從事RNAi相關實驗的研究人員以幫助,。
哺乳動物細胞的RNAi技術策略
一、靶siRNA序列選擇
靶siRNAA序列選擇是RNAi實驗成敗的關鍵,。哺乳動物細胞RNAi實驗中,，使用zui廣泛且zui有效的是21bp siRNA。siRNA由正義鏈和反義鏈組成,，兩條鏈3’端均有2個堿基突出,，一般為UU或dTdT，其中正義鏈的前19nt與靶基因序列相同,。
1. siRNA設計的原則
SiRNA雙鏈設計時，一般在靶mRNA起始密碼下游100—200bp至翻譯終止密碼上游d0—100bp的范圍內(nèi)搜尋AA序列,，并記錄每個AA3’端相鄰19個核苷酸作為候選si.RNA靶位點,。其中AA（N19）TT是的序列，若靶mRNA中無此序列,，亦可選用NA（N21）或NAR（N17）YNN（R表示嘌呤,，Y表示嘧啶），但在合成時,，siRNA的正義鏈3’端需用dT—dT代替,。TuscRl等建議設計的siRNA不要針對mRNA的5’和3’端非編碼區(qū)，因為這些區(qū)域有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合位點,，而UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP（siRNA protein complex,，核酸內(nèi)切酶復合物）結(jié)合mRNA，從而影響siRNA干擾的效果,。zui后還應將候選siRNA序列在GenBank進行BLAST檢索,，與非同源基因具有3個或哺乳動物細胞的RNAi技術策略
3個以上堿基相異的序列方可選用,。
2. siRNA的序列結(jié)構特征
除了靶序列位點的選擇，siIRNA序列本身結(jié)構特征亦會影響到RNAi效率,。RNAi實質(zhì)上可視為一個RNA與蛋白質(zhì)互作過程,，包括siRNA與RISC結(jié)合、RISC的激活以及RISC與靶mRNA的結(jié)合和切割,，這種互作效應的存在,，往往造成siRNA鏈的選擇具有偏愛性。Reynolds等通過對2個基因的180條siRNA序列分析,，歸納出以下8個與siRNA性相關的特征:G/C含量低（30%-52%）,，正義鏈3’端具較低穩(wěn)定性（有利于siRNA與RISC的結(jié)合和解鏈），無反向重復序列（有利于減小siRNA的有效作用濃度,，提高siRNA干擾效率）,，正義鏈堿基的偏愛性A19（正義鏈中第19位堿基為A，如下表示類同）,；A3,；U10；無G/C（正義鏈中第19位堿基不為G或C）,；無G13,。依此規(guī)則，Reynolds等設計的30條siRNA中有29條是有效的,。Kumiko等亦認為siRNA反義鏈5’端為A/U（即有義鏈U/A）19和zui后7個堿基中有5個A/U,，會有助于RNAi的發(fā)揮，且正義鏈G/C1和序列中無連續(xù)9nt以上的GC重復片段與基因沉默效率呈顯著相關,。有趣的是,，該實驗還表明這些規(guī)則同樣適用于DNA介導的RNAi（DNA-based RNAi.）實驗。此外,，Amarzguioui等發(fā)現(xiàn)正義鏈5’與3’端的前3個堿基中A/U含量不對稱（3’端含量應高一些）和A6對siRNA 的活性亦影響很大,。根據(jù)上述結(jié)果，可以初步繪制出一個siRNA序列結(jié)構的精細與簡略示意圖,。

現(xiàn)已知道siRNA的反義鏈決定著靶位點識別,，那么在不影響siRNA作用功效的前提下，是否可以對其正義鏈堿基作適當更改或修飾呢,？Amarzguioui等研究siRNA不同部位對堿基突變和化學修飾的耐受性,，認為siRNA的5’端相對于3’端具有對突變的較高耐受性。有學者認為正義鏈3’突出端的任何堿基修飾對siRNA作用效果均無明顯影響,。還有學者認為與反義鏈互補的正義鏈3’端發(fā)生1—4個堿基的錯配反而有助于增強RNAI的活性,。
二、siRNA制備方法
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括
化學合成
體外轉(zhuǎn)錄
長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 （e.g. Dicer, E. coli, RNase III）
siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經(jīng)過轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)導入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達siRNAs的DNA載體或者表達框轉(zhuǎn)染到細胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點和缺點,。哪種是的方法,，其實取決于實驗目的。這里簡單介紹這5種方法,，優(yōu)點和缺點,，以及它們的應用。
siRNA的設計
除了方法3以外,，其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列,。關于怎樣設計siRNA以及siRNA設計對siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來越多有關設計原則的信息,。但這仍然不是的,。通常來說，每個目標序列設計3—4對siRNAs,，在后面的實驗中選擇zui有?的那個,。網(wǎng)上有提供免費的siRNA設計工具。
體外制備
1.化學合成
盡管化學合