人基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)ELISA試劑盒的操作步驟

背景[1-3]

人基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)ELISA試劑盒采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法,，用于體外定量分析人血清,、血漿、細胞裂解液,、唾液,、尿液或細胞培養(yǎng)上清中MMP-7的含量。

檢測原理：預(yù)先包被的抗體和檢測相抗體都是親和純化級的MMP-7多克隆抗體,。檢測抗體經(jīng)生物素標(biāo)記,。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS或TBS洗滌,。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng),；經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的,。顏色的深淺和樣品中的MMP-7呈正相關(guān),。

人基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)ELISA試劑盒

基質(zhì)金屬蛋白酶是依賴鋅和鈣的內(nèi)肽酶，能夠降解細胞外基質(zhì)的所有成分,。它們在許多生理過程中發(fā)揮重要作用,，如胚胎發(fā)育、組織成型,、復(fù)制,、再生等。它們參與很多病理過程如關(guān)節(jié)炎,、癌癥、心血管疾病,。新合成MMPs的量主要由復(fù)制水平控制,。MMPs的活性主要由酶原的活化和其抑制蛋白質(zhì)（TIMPs）所調(diào)節(jié)。MMP-7由正常和疾病組織的上皮細胞分泌,。MMP-7可降解一系列基質(zhì)如Ⅳ型膠原,，明膠，彈性蛋白和層聯(lián)蛋白,。MMP-7還能激活UPA和前MMP-1,2,9,。本試劑盒所用標(biāo)準(zhǔn)品為重組人MMP-7，包含250個氨基酸,，分子量28KDa,。所檢測MMP-7包括酶原和活性酶。

操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,，用戶可按照隨貨說明書中圖表在小試管中進行稀釋,。

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外。

7.溫育：操作同3,。

8.洗滌：操作同5,。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)）,。

11.測定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。