抗體的制備方法和原理之抗血清的制備的方法有哪些呢？

一,、用于免疫的動(dòng)物

作免疫用的動(dòng)物有哺乳類和禽類,，主要為羊、馬,、家兔,、猴、豬,、豚鼠,、雞等，實(shí)驗(yàn)室常用者為家兔,、山羊和豚鼠等。動(dòng)物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量,，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清,，多用家兔和山羊，因動(dòng)物反應(yīng)良好,，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清,，用于免疫的動(dòng)物應(yīng)適齡，健壯,，無感染性疾患,，為雄性，此外還需十分注意動(dòng)物的飼養(yǎng),，以消除動(dòng)物的個(gè)體差異以及在免疫過程中死亡的影響,。若用兔，用純種新西蘭兔,，一組三只,，兔的體重以2～3kg為宜。

二,、免疫途徑

免疫途徑有多種多樣,，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi),、肌肉內(nèi),、皮內(nèi)、皮下,、淋巴結(jié)內(nèi)注射等,，一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1ml左右,。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性,，如激素,、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原,，一般不宜采用靜脈注射,。

三、佐劑

由于不同個(gè)體對(duì)同一抗原的反應(yīng)性不同,，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱,，因此常常在注射抗原的同時(shí)，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì),，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng),，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。

佐劑除了延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間,，增加抗原刺激作用外,，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多,，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生,。

常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,，其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份,，羊毛脂與石臘油的比例,，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不*福氏佐劑,，在每毫升不*佐劑加入1～20mg卡介苗就成為*佐劑,。

配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻,，高壓滅菌,，置4℃下保存?zhèn)溆谩Ｃ庖咔叭〉热莘e*或不*佐劑與免疫原溶液混合,，用振蕩器混勻成乳狀,，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加）,，加完后再繼續(xù)研磨成乳劑,，滴于冰水上5～10min內(nèi)*不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原,，亦可用一注射器裝抗原液,，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸,，約數(shù)十分鐘后即能*乳化,。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

四,、免疫方法

抗原劑量,，開始劑量為300～500μg，加強(qiáng)免疫的劑量約為開始劑量為1/4左右,。每2～3周加強(qiáng)免疫一次,。加強(qiáng)免疫時(shí)用不*佐劑，開始免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0.5ml,，加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗,。

在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血,，制備血清,，檢測(cè)抗體效價(jià)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià),，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫,，直到滿意時(shí)為止。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí),，即可放血制備抗血清。

五,、抗血清的采集與保存

家兔是常用以產(chǎn)生抗體的動(dòng)物,，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動(dòng)物以頸靜脈,、動(dòng)脈取血,，鼠等小動(dòng)物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法,，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血,，一是頸動(dòng)脈入血，也可心臟采血,。取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí),，將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外,，也可由另一人捉住兔身,。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓,，30s后,，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖,，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片,，快速切開動(dòng)脈或靜脈，血液即流出,，每次可收集30～40ml ,。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯,。二星期后,，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血,。頸動(dòng)脈放血時(shí),，將兔仰臥，固定于兔臺(tái),，剪去頸部的毛,，切開皮膚，暴露頸動(dòng)脈,，插管,，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行,。

收集的血液置于室溫下1h左右,，凝固后，置4℃下,，過夜（切勿冰凍）析出血清,，離心，4000rpm,，10min,。在無菌條件，吸出血清,，分裝（0.05～0.2ml）,，貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4,。C冰箱保存,。

六、抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)

在免疫期間,，不僅各個(gè)不同的動(dòng)物,，而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性,、親合力等都可能發(fā)生變化,，因而必須經(jīng)常地采血測(cè)試。只有在對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性,、親合力等方面作*的評(píng)價(jià)后,，才可使用所取得的抗血清。

1,、效價(jià)

抗血清的效價(jià),，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測(cè)定的方法常用的是放射免疫法,，此法對(duì)所有的抗體均適用,。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測(cè)定,。前者測(cè)定的效價(jià)極為精確,。而后者則粗糙得多。

（1）放射免疫法

以不同稀釋度的抗血清與標(biāo)記抗原混合,，孵育24h后,，測(cè)定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價(jià),。如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為1：15000,，則該血清的效價(jià)就是1：15000?？寡宓男r(jià),，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量,、孵育時(shí)間,，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意,。

（2）雙向擴(kuò)散法

利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線,，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度,。

球脂板的制備：100ml pH 7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫,，攪拌,，使瓊脂*溶解，趁熱用紗布過濾,，待溶液冷卻到65℃左右時(shí),，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%,。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上,，約3mm厚，待其冷卻，*凝固后,，用打孔器打孔,。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1：2,、1：4,、1：8、1：16,、1：32及不稀釋的抗血清,，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生,，以判斷血清的稀釋度,。

2、特異性測(cè)定

抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對(duì)相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識(shí)別能力,。特異性好就是抗血清的識(shí)別能力強(qiáng),。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的,。交叉反應(yīng)率低,，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差,。交叉反應(yīng)率一般是用競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線來判斷的,。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0）,，求出各自在IC50時(shí)的濃度,，按下列公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。