抗體的制備方法和原理之抗血清的制備的方法有哪些呢,？

一,、用于免疫的動物

作免疫用的動物有哺乳類和禽類,，主要為羊,、馬,、家兔,、猴、豬,、豚鼠,、雞等，實驗室常用者為家兔,、山羊和豚鼠等,。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量,，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊,，因動物反應(yīng)良好,，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動物應(yīng)適齡,，健壯,，無感染性疾患，為雄性,，此外還需十分注意動物的飼養(yǎng),，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔,，用純種新西蘭兔,，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜,。

二,、免疫途徑

免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi),、腹腔內(nèi),、肌肉內(nèi)、皮內(nèi),、皮下,、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射,，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性,，如激素,、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原,，一般不宜采用靜脈注射,。

三、佐劑

由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同,，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強有弱,，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強抗原的抗原性物質(zhì),，以刺激機體產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng),，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。

佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間,，增加抗原刺激作用外,，更主要的是,，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細胞增多,，促進T細胞與B細胞的相互作用,，從而增強機體對抗原的細胞免疫和抗體的產(chǎn)生。

常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,，其成分通常是羊毛脂1份,、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例,，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V）,，這是不*福氏佐劑，在每毫升不*佐劑加入1～20mg卡介苗就成為*佐劑,。

配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi),，用超聲波使之混勻，高壓滅菌,，置4℃下保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積*或不*佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀,，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨,，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑,，滴于冰水上5～10min內(nèi)*不擴散為止,。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液,，另一注射器裝佐劑,，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸,，約數(shù)十分鐘后即能*乳化,。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

四,、免疫方法

抗原劑量,，開始劑量為300～500μg，加強免疫的劑量約為開始劑量為1/4左右,。每2～3周加強免疫一次,。加強免疫時用不*佐劑，開始免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml,，加強免疫時不必注射百日咳疫苗,。

在第2次加強免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血,，制備血清,，檢測抗體效價,。如未達到預(yù)期效價，需再進行加強免疫,，直到滿意時為止,。當(dāng)抗體效價達到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清,。

五,、抗血清的采集與保存

家兔是常用以產(chǎn)生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集,。羊等較大動物以頸靜脈,、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料,。取兔血有兩種方法,，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血,，也可心臟采血,。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi),，耳露于箱（籠）外,，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛,，用少許二甲苯涂抹耳廓,，30s后，耳血管擴張,、充血,。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片,，快速切開動脈或靜脈,，血液即流出，每次可收集30～40ml ,。然后用棉球壓迫止血,，凝血后洗去二甲苯,。二星期后,，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血,。頸動脈放血時,，將兔仰臥，固定于兔臺,，剪去頸部的毛,，切開皮膚,，暴露頸動脈，插管,，放血,。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進行。

收集的血液置于室溫下1h左右,，凝固后,，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清,，離心,，4000rpm，10min,。在無菌條件,，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml）,，貯于-40℃以下冰箱,，或凍干后貯存于4。C冰箱保存,。

六,、抗血清質(zhì)量的評價

在免疫期間，不僅各個不同的動物,，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價,、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化,，因而必須經(jīng)常地采血測試,。只有在對抗血清的效價、特異性,、親合力等方面作*的評價后,，才可使用所取得的抗血清。

1,、效價

抗血清的效價,，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法,，此法對所有的抗體均適用,。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴散等方法測定,。前者測定的效價極為精確,。而后者則粗糙得多。

（1）放射免疫法

以不同稀釋度的抗血清與標(biāo)記抗原混合,，孵育24h后,，測定其結(jié)合率,。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000,，則該血清的效價就是1：15000,。抗血清的效價,，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外,，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時間,，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響,，在工作中必須引起注意。

（2）雙向擴散法

利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散,，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線,，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

球脂板的制備：100ml pH 7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi),，于水浴中加溫,，攪拌，使瓊脂*溶解,，趁熱用紗布過濾,，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3）,，使其在溶液中的濃度為0.1%,。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚,，待其冷卻,，*凝固后，用打孔器打孔,。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl）,，周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1：2、1：4,、1：8,、1：16、1：32及不稀釋的抗血清,，37℃下孵育24h,，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度,。

2,、特異性測定

抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力,。特異性好就是抗血清的識別能力強,。通常,，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低,，表示抗血清的特異性好,，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的,。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線,，計算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度,，按下列公式計算交叉反應(yīng)率,。