酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗(yàn)操作步驟和注意事項(xiàng)有哪些呢,？本文將為你一一解答,。

一、實(shí)驗(yàn)方法原理

本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體,，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品,，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在,，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后,，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體,，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定,，底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量,。

這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，因?yàn)槠湟欢艘挥诠滔噍d體上的抗體作用,，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用,。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測(cè)定,。我們用在霍亂腸毒素的測(cè)定,。HbSAg及HbS的測(cè)定。

二,、實(shí)驗(yàn)材料

1.樣本：血清 血漿 體液

2.試劑,、試劑盒：碳酸鹽包被緩沖液 抗體球蛋白 吐溫 檸檬酸 硫酸

3.耗材：酶標(biāo)比色計(jì) 96孔板 移液槍 離心管 離心管盒

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至適濃度（1～10 ug /ml）,，每凹孔加0.3 ml,，4℃過(guò)夜，或37℃水浴3小時(shí),，貯存冰箱,。

2.洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次,，每次5分鐘,。

3.每凹孔加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標(biāo)本，37℃作用1～2小時(shí),。

4.洗滌：移去包被液,，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘,。

5.加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液,，37℃作用1～2小時(shí)或由預(yù)試實(shí)驗(yàn)確定作用時(shí)間。

6.洗滌：移去包被液,，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次,，每次5分鐘。

7.加入0.2ml底物溶液于每個(gè)凹孔(OPD或OT),，室溫作用30分鐘（另作一空白對(duì)照,，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。

8.加終止劑：每凹孔加2M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。

9.觀察記錄結(jié)果：目測(cè)或用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定（OPD用492nm）OD值,。

四,、注意事項(xiàng)

1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件,。許多物質(zhì)可作為固相載體,，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷,、聚丙烯,、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管,。

2.包被所用的抗原必須是可溶性的,，而且要求是和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高,。如果不純,，由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性,。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性,。

3.對(duì)某些抗原必須進(jìn)行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等,，它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì),，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純,，不經(jīng)提純是不能使用的,。

4.用適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì),，而且可以克服前帶現(xiàn)象,。可通過(guò)棋盤(pán)滴定法進(jìn)行測(cè)定,，但用單項(xiàng)滴定法更為簡(jiǎn)便,，其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板,，再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌,，再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)孵育洗滌后,，加底物溶液顯色,，終止反應(yīng)后分別測(cè)定OD值，選擇OD值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為適包被濃度,。一般總是要選擇那個(gè)OD值稍大于1.0,，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2,。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別,。