ELISA檢測(cè)試劑盒中一般有3次加樣步聚,，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物,，加底物,。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部,，并留意不行濺起,，不行產(chǎn)生氣泡。

在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反響,，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后,。抗原抗體反響的完結(jié)需要有一定的溫度和時(shí)刻,，這一保溫進(jìn)程稱為溫育（incubation）,，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng),。

加標(biāo)本一般用微量加樣器,，按規(guī)則的量參加板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴,，避免發(fā)作交叉污染,，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)則的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中參加稀釋液，ELISA試劑盒再在其間參加血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保 證混和,。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器,，使加液進(jìn)程迅速完結(jié)。
ELISA屬固相,，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)作。

以抗體包被的夾心法為例,，參加板孔中的標(biāo)本,，其間的抗原并不是都有平等的和固相抗結(jié)合的時(shí)機(jī)，只要貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體觸摸,。這是一個(gè)逐步平衡的進(jìn)程，因而需經(jīng)分散才能達(dá)到反響的結(jié)尾,。在其后參加的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此,。這便是為什么ELISA反響總是需要一定時(shí)刻的溫育。

溫育常選用的溫度有43℃,、37℃,、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELISA試劑盒辦法作反響動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)標(biāo)明,，兩次抗原抗體反響一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí),，ELISA檢測(cè)試劑盒產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反響,，可提高反響的溫度,，有些實(shí)驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜選用更高的溫度,?？乖贵w反響4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反響在冰箱中,，以構(gòu)成多的沉淀,。但因所需時(shí)刻太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予選用,。