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(二)特異性強
自從提取出耐熱TaqDNA聚合酶以來,在熱變性處理時不被消化,、不必在每次循環(huán)擴增中再加入新酶,,以及在較高溫度下連續(xù)反應,顯著提高了PCR反應產(chǎn)物的特異性,。PCR擴增的特異性還依賴于兩個引物設計的好壞,,依賴于引物與模板結合的正確性。PCR反應時退火溫度對特異性也有影響,,一般來說,,退火溫度越高,擴增的特異性越好,。高溫啟動法也可增加PCR擴增的特異性,,即通過在高溫(70℃)下加入某些必需因子(DNA聚合酶、模板DNA,、Mg2+或引物等),,使TaqDNA聚合酶僅在反應達到較高溫度(>70℃)時才發(fā)揮作用。其他因素如酶濃度,、dNTP,、Mg2+、pH值等對PCR的特異性也有一定的影響,。
一)敏感性高
如前所述,PCR產(chǎn)物的生成以指數(shù)方式增加,,能將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA,。這是PCR技術zui主要的特點,,它可對單拷貝基因、單個細胞,、單根頭發(fā),、一滴血等微量標本進行分析。
(三)操作簡便,、快速
目前國內(nèi)外已有多種類型的PCR擴增儀,,只需把反應材料按一定濃度混合,置于儀器內(nèi),,反應便按所輸入的程序進行,。整個PCR操作過程,從標本處理,、PCR擴增到產(chǎn)物分析,,可在4h內(nèi)完成全部實驗。擴增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆,,擺脫繁瑣的基因分析方法,;可直接從總RNA或DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因,省去須先進行克隆后再作序列分析的模式,。已固定和包埋的組織或切片亦可用于檢測,。
(四)可擴增RNA或cDNA
先按通常方法用寡脫氧核苷酸引物和反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)錄成主鏈cDNA,再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增,。即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有cDNA中的0.01%,,也能經(jīng)PCR擴增出10倍242bp對長度的特異性片段。有些外顯子分散在一段很長的DNA中,,難于將整段DNA大分子擴增和做序列分析,。若以mRNA作為模板,則可將外顯子集中,,用PCRl次便完成對外顯子的擴增并進行序列分析,。
(五)有一定程度單核苷酸錯誤摻入
TaqDNA聚合酶缺少3’-5’核酸外切酶活性,因而不能糾正反應中發(fā)生的核苷酸錯誤摻人,;與大腸桿菌聚合酶I Klenow片段相比較,,用TaqDNA聚合酶的反應錯誤摻人相對多些。但在PCR擴增過程中,,其錯配率一般只有約1/萬,,足可以供特異性分析。
(六)對起始材料質(zhì)量要求低
PCR技術對擴增樣品的要求不高,,僅含極微量目的DNA(pg,、ng)、DNA粗制樣品或者總RNA,,都可用做起始材料來獲得較多的目的產(chǎn)物,。擴增樣品既可以是純化的,,也可以是粗制的;既可以是新鮮組織,,也可以是陳舊樣品,;既可以是細胞,也可以是體液,;既可以是完整的大分子,,也可以是部分降解的DNA。
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