會(huì)員.png)
7
當(dāng)前位置：賽默飛測(cè)量控制與材料鑒別>>公司動(dòng)態(tài)>>實(shí)現(xiàn)高通量解析SARS-CoV-2刺突蛋白與不同抗體結(jié)合的表位結(jié)構(gòu)
實(shí)現(xiàn)高通量解析SARS-CoV-2刺突蛋白與不同抗體結(jié)合的表位結(jié)構(gòu)
針對(duì)SARS-CoV-2刺突蛋白的治療性抗體可保護(hù)脆弱人群遠(yuǎn)離嚴(yán)重或具有潛在威脅的疾病,，這在幫助緩解當(dāng)前肺炎疫情大流行中發(fā)揮著重要作用,。冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）是一種強(qiáng)大的儀器,，可用于繪制阻斷SARS-CoV-2病毒入侵的抗體表位圖[1],。通過(guò)解析SARS-CoV-2和抗體結(jié)合的表位,，可以使我們能夠了解它們之間的作用機(jī)制,，并增加我們對(duì)抗體如何賦予保護(hù)性免疫力的認(rèn)知。此外,，對(duì)抗體表位和作用機(jī)制的精確了解,，也可以指導(dǎo)抗體療法的改進(jìn)，生產(chǎn)新的抗體治療藥物,。例如,，冷凍電鏡解析了刺突蛋白和不同抗體的非重疊結(jié)合表位，從而促進(jìn)了 “抗體雞尾酒" 療法的研發(fā),，降低了病毒逃逸的風(fēng)險(xiǎn)[2],。
目前， 肺炎疫情大流行的主要原因之一是SARS-CoV-2 不斷變異,，新變異毒株可能逃避免疫。其中一個(gè)便是Omicron（B.1.1529）變異株,，在其與受體結(jié)合區(qū)域 (receptor-binding domain) ,，含有迄今為止最多的突變位數(shù)量。刺突蛋白和抗體結(jié)合的表位結(jié)構(gòu),，能快速識(shí)別刺突蛋白脆弱位點(diǎn),，并預(yù)測(cè)和解釋新突變可能帶來(lái)的影響，還能加快針對(duì)非重疊結(jié)合表位的抗體組合決策選擇效率,。此外,，關(guān)于表位的結(jié)構(gòu)信息，可以幫助確定新的藥物研發(fā)管線(xiàn),，以應(yīng)對(duì)新出現(xiàn)的變體,。因此，如何使用冷凍電鏡加速抗原抗體表位篩選成為我們所考慮的問(wèn)題之一,。
在這里,，我們將探討如何通過(guò) Thermo Scientific™ EPU 軟件 的EPU Multigrid收集功能將 cryo-EM 用于高通量表位作圖。在本研究中,，我們從 12 種臨床前階段抗體中,，生成并表征了一組針對(duì)受體結(jié)合域的特異性SARS-CoV-2中和抗體。這組抗體代表了一系列 SARS-CoV-2 抗體的中和效力,、親和力及其余六種粗表位庫(kù),。這六種抗體表位庫(kù)中，大部分抗體來(lái)自 肺炎 患者,，另一些來(lái)自人抗IgG 動(dòng)物的免疫接種,。在此,， 我們展示了如何從為期 2 天的無(wú)人值守冷凍電鏡中，在12 個(gè)含有不同 Fab 的spike-Fab復(fù)合物的載網(wǎng)上獲得12個(gè)優(yōu)于3 ?的刺突蛋白結(jié)構(gòu)（圖 1）,。
圖1. 使用EPU Multigrid在200kV Glacios Cryo-TEM上實(shí)現(xiàn)的SARS-CoV-2刺突蛋白抗體的高通量冷凍電鏡表位圖,。
我們使用Glacios Cryo-TEM和Falcon 4直接電子檢測(cè)相機(jī)對(duì)SARS-CoV-2刺突蛋白進(jìn)行單顆粒分析。在此實(shí)驗(yàn)中,，在1.5小時(shí)內(nèi)收集了28,162個(gè)顆粒,，并計(jì)算重構(gòu)了一個(gè)3.1埃的刺突蛋白膜外區(qū)結(jié)構(gòu)（圖2）。
圖2. 使用Glacios Cryo-TEM和Falcon 4直接電子檢測(cè)相機(jī)對(duì)SARS-CoV-2刺突蛋白進(jìn)行單顆粒分析,。右圖,，代表包含搭建原子結(jié)構(gòu)的密度圖（PDB ID：6XR8）。
EPU Atlas Screening用于收集總共24個(gè)載網(wǎng)的圖像,，并從中選出12個(gè)最佳的載網(wǎng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,。EPU Multigrid可以通過(guò)使用 "Max Exposures "選項(xiàng)限制每個(gè)載網(wǎng)拍攝的圖像數(shù)量來(lái)進(jìn)行篩選工作。為了衡量我們的12個(gè)載網(wǎng)是否具有解析高分辨結(jié)構(gòu)的質(zhì)量,，我們?cè)贕lacios Cryo-TEM上使用EPU Multigrid,，為每個(gè)spike-Fab復(fù)合物收集50張圖像。將這些小數(shù)據(jù)集在cryoSPARC Live軟件中進(jìn)行預(yù)處理[3],。在獲得良好的預(yù)處理結(jié)構(gòu)后,，我們繼續(xù)對(duì)12個(gè)經(jīng)過(guò)篩選的載網(wǎng)使用Thermo Scientific Krios™ G4 Cryo-TEM進(jìn)行無(wú)人值守EPU Multigrid數(shù)據(jù)收集（其中Krios™ G4配備了E-CFEG冷場(chǎng)電子槍、Thermo Scientific Selectris™ X能量過(guò)濾器和Thermo Scientific Falcon 4直接電子檢測(cè)相機(jī)）,。我們將EPU Multigrid設(shè)置為每個(gè)載網(wǎng)收集1,000張圖像,，實(shí)現(xiàn)了每小時(shí)250張圖像的速度。數(shù)據(jù)采集參數(shù)請(qǐng)見(jiàn)表1,。
表1.冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集參數(shù)
使用4塊GPU的工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,，每個(gè)數(shù)據(jù)集處理耗時(shí)約12小時(shí)，計(jì)算結(jié)構(gòu)顯示12個(gè)spike-Fab復(fù)合物的分辨率都優(yōu)于3 ?（見(jiàn)表2）,。
表2. 不同spike-Fab復(fù)合物的整體和局部分辨率,。
使用cryoSPARC軟件對(duì)Krios G4 Cryo-TEM收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行3埃內(nèi)的結(jié)構(gòu)重建。在漂移校正和CTF校正后,，使用blob picker挑選顆粒,，4x binning提取顆粒，并進(jìn)行二維分類(lèi),。本研究中的Fabs來(lái)自臨床前開(kāi)發(fā)階段的抗體,，其特征在于SARS-CoV-2和變異假病毒的中和等特征。在此,，我們突出顯示了來(lái)自12個(gè)Spike-RBD中S2和RBD的密度,，以代表整體分辨率和局部分辨率（圖3）。
圖3. 本研究中的12個(gè)spike-Fab復(fù)合物的S2和RBD的代表性密度。S2通常是刺突蛋白中分辨率最高的部分,。因此,，S2的密度代表了整體分辨率。相反,，RBD-Fab區(qū)域是多變的,，通常分辨率很低。在這項(xiàng)研究中,。對(duì)RBD-Fab區(qū)域進(jìn)行了local refinement,，以提高表位的局部分辨率。因此,，RBD密度代表了與表位相鄰區(qū)域的局部分辨率,。
冷凍電鏡更快速的數(shù)據(jù)收集與EPU Multgrid功能的實(shí)現(xiàn)，促進(jìn)了基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)和抗原抗體結(jié)合表位的高通量篩選[4],。
想要了解更多,，微信掃碼即可獲取原文件
References
1. C. O. Barnes et al., SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies, Nature, vol. 588, no. 7839, pp. 682–687, Dec. 2020.
2. J. Hansen et al., Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail, Science (New York, N.Y.), vol. 369, no. 6506, pp. 1010–1014, Aug. 2020.
3. A. Punjani, J. L. Rubinstein, D. J. Fleet, and M. A. Brubaker, cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination, Nature Methods, vol. 14, no. 3,
pp. 290–296, 2017.
4. M. Saur et al., “Fragment-based drug discovery using cryo-EM," Drug Discovery Today, vol. 25, no. 3, pp. 485–490, 2020.