1.加裝保護柱
保護柱的作用是過濾掉來自流動相和樣品的化學“拉圾”同時也可以有效除去流動相和樣品中的不溶物。盡管現(xiàn)在的色譜儀在流動相吸入口,、進樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1,、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學污然,因此,加裝保護柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等復雜混合物和生物樣品時更是保護分析柱不可少的措施,。
保護柱填料應與分析柱一致,粒徑可較分析柱大,。保護柱屬消耗品,經(jīng)過一定次數(shù)的樣品分析(50～100次)后,出現(xiàn)柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時,應考慮更換保護柱。
2.過濾流動相和樣品
流動相通常由水或緩沖溶液與有機溶劑混合而成,原則上,所有經(jīng)過色譜柱的流動相均應過濾,但在實際操作上應視具體情況而有所區(qū)別:當有機溶劑用色譜純級,水用石英亞沸水或其它超純水時,在能確保水和有機溶劑的質(zhì)量且沒有受到污染時,過濾并無更多實際意義,。
當流動相中含有緩沖鹽時,則過濾是必要的,如前所述,當緩沖溶液放置一段時間(視環(huán)境溫度不同而異,夏季一般不超過48h,冬季一般不超過一周)后,在使用前還應重新過濾,。
所配制的樣品試液在注入流路系統(tǒng)前均要經(jīng)0.45μm（0.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區(qū)分水系和油系,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成污染。裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過載而起不到過濾作用,。
3.凈化樣品
當樣品中含有對色譜柱有損害的化學成分,如產(chǎn)生永久性吸附的蛋白質(zhì),、糖等有機分子和強吸附性物質(zhì),以及可能對柱填料產(chǎn)生破壞作用的基團離子。在進樣前應盡可能對樣品進行分離提純以除去多余雜質(zhì)組分,。
4.避免過高的柱壓
雖然高效液相色譜柱能耐受的壓力可達6000psi(磅/平方英寸),但過高及過大的壓力變化均會縮短色譜柱的壽命,避免的方法是：
(1)柱壓過高時,盡可能采用較小的流速,以不超過柱最大允許壓力的一半為宜,。
(2)當流速較大時,應采取流速梯度的辦法使流速分步到位。
(3)使用手動進樣閥時,進樣閥的切換要盡可能的快,。否則
超過20%的壓力沖擊會很快使柱報廢,。當使用多柱聯(lián)用時,柱切換要避免在高壓下進行。
5.注意溫度和酸堿度
一般以硅膠為基質(zhì)的色譜柱最高使用溫度不超過60℃,，以低于40℃為宜,，特別是在流動相pH接近使用限度時，更應降低使用溫度,。溫度過高會加快鍵合相的水解和硅膠的溶解,，從而，使填料性質(zhì)改變,，柱床塌陷,，降低柱效，改變峰形,。目前的鍵合硅膠色譜柱標示的pH適用范圍可達2～10,但在實際使用時應避免極端的pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用,如必須要在極端的pH條件下使用時,可通過以下方法避免柱損害:
（1）在泵和進樣閥之間加裝預柱(飽和柱)來飽和流動相,；
（2）降低使用溫度；
（3）檢驗完畢后立即用與所使用的流動相互相混溶的“溫和溶劑”徹底清洗,。
6.正確及時的沖洗
開始試驗前,，應了解柱中當前是何種溶劑。對于新色譜柱,如無特殊說明均為評價報告中所用流動相,。柱中當前溶劑一定要與分析樣品所用流動相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過渡,。異丙醇是能與各種溶劑混溶的試劑，可作為中介流動相使用,。反相鍵合硅膠柱適宜的保存環(huán)境是純甲醇,如分析用流動相為緩沖液2有機溶劑,可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇2水置換掉原來的純甲醇,再進分析用流動相,，以防止在柱內(nèi)發(fā)生鹽的沉淀；
試驗結(jié)束后,要及時用適當?shù)娜軇_洗系統(tǒng)并最終過渡到純甲醇沖洗,對于含有緩沖鹽的流動相,，最好的辦法是先用與分析用流動相組成相同但不含緩沖鹽的溶液進行沖洗,，再逐步過渡到純甲醇沖洗。多數(shù)報道沖洗液體積大約為柱容積的15～20倍,但最終要以基線是否平直,、壓力是否穩(wěn)定決定,。有些廠家的色譜柱標明了流動相中有機相的最低使用濃度為≥5%，使用時應給予注意,。
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