紅外顯微光譜法是非破壞性、結構敏感的檢測方法,，目前已在基于分子結構的單細胞領域的研究中發(fā)揮重大作用,，諸如蛋白構象改變,、氧化還原,、脂質(zhì)體的產(chǎn)生與降解等,。但是受制于紅外光譜儀本身的限制,，對于生物組織樣品來說制樣非常困難,，因此極大的限制了紅外光譜在生物醫(yī)學方面的應用。

O-PTIR (Optical Photothermal Infrared) 光學光熱紅外光譜是一種快速簡單的非接觸式光學技術，通過檢測由于本征紅外吸收引發(fā)的樣品表面快速的光熱膨脹或收縮,，克服了傳統(tǒng)IR衍射的極限,，空間分辨率可達500 nm。

近期，美國PSC公司又推出了非接觸亞微米分辨熒光紅外拉曼同步測量系統(tǒng)mIRage-LS,，將O-PTIR技術與熒光（FL）進一步有機結合,，利用落射熒光快速定位 O-PTIR 測量的區(qū)域,，提供了對樣品熒光標記區(qū)域以及鄰近未標記組織的化學結構的快速光譜分析,。

圖 1. FL-OPTIR 顯微鏡基本原理和觀測方法

這項全新的技術對樣品要求非常低,，而紅外光譜的空間分辨率可達亞微米級別,，為紅外光譜在生物醫(yī)學方面的應用提供了全新的視角。比如在阿爾茨海默病 (AD) 研究方面,，AD的關鍵病理特征是淀粉樣蛋白折疊,，這些 β-折疊結構具有特定的振動特征，對于紅外光譜來說十分敏感,，但是受制于傳統(tǒng)紅外光譜儀本身的限制,，在生物組織樣品上直接測量非常困難,。而非接觸式的FL-PTIR技術卻能夠很好適用于這些樣品,，并且已經(jīng)有多個小組通過實驗證明了FL-PTIR能夠應用于具有特殊化學敏感性的活細胞成像研究。

Craig Prater等人通過這項技術成功實現(xiàn)了熒光定位下的OPTIR紅外觀測,，并且完成了對組織中單個病理結構內(nèi)的 β-折疊結構進行結構分析,、在腦組織的特定細胞和培養(yǎng)的原代神經(jīng)元分析,。首先，作者使用了12個月周齡的 APP/PS1 轉基因小鼠的大腦切片,，用淀粉樣蛋白特異性發(fā)光共軛聚電解質(zhì)探針mytracker R（Ebba Biotech,，Solna,，Sweden）進行標記，并用OPTIR進行觀測β 折疊結構的分布,。相比于傳統(tǒng)紅外很難定位的問題,，F(xiàn)L-OPTIR通過寬場熒光能夠快速定位淀粉樣蛋白斑塊,。并直接在腦組織中評估其在單個斑塊中的結構,。通過 k 均值聚類方法對其進行分析,，清楚地顯示了在 1630 cm^–1處具有高振幅和低振幅的兩組光譜的存在,，并且具有 1630 cm^–1高振幅的光譜清楚地與熒光信號共定位,。光譜分析表明 Amytracker 沒有對酰胺 I 和 II 區(qū)域有明顯的吸收,，因此表明 Amytracker 可用于 OPTIR 測量的熒光引導。

圖 2. FL-OPTIR 對腦組織中的淀粉樣斑塊進行成像熒光和紅外圖譜和熱圖的展示,。

在第二個實驗中,，作者提供了一個概念性方法驗證實驗,，證明 FL-OPTIR 可用于研究組織中的特定細胞類型，而這對傳統(tǒng)紅外顯微光譜法來說十分具有挑戰(zhàn)性,。為此作者對腦組織中與淀粉樣斑塊相關的小膠質(zhì)細胞進行成像,，以評估它們的光譜特征，從而了解小膠質(zhì)細胞是否可以將 Aβ 原纖維轉化為單體的問題,。這個實驗使用 Aβ 特異性抗體 82E1 標記的 16 μm 組織切片,，并用抗體 Iba1 對小膠質(zhì)細胞進行了免疫標記。通過FL-OPTIR可以定位淀粉樣斑塊附近的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞并測量 OPTIR 光譜,。通過測量,，發(fā)現(xiàn) 82E1 陽性小膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出β-折疊含量升高，表明小膠質(zhì)細胞與 Aβ 原纖維相關,。

圖 3. 腦組織中淀粉樣斑塊周圍小膠質(zhì)細胞的成像。

在第三個實驗中,，作者研究了 FL-OPTIR 在培養(yǎng)的原代神經(jīng)元中 Aβ結構成像的適用性,。與組織研究類似，淀粉樣蛋白的結構異質(zhì)性使得研究神經(jīng)毒性與 Aβ 結構之間的關系仍具有挑戰(zhàn)性,。因此，為了直接評估神經(jīng)元中的淀粉樣蛋白結構,，作者使用FL-OPTIR技術基于熒光信號引導的光譜測量，發(fā)現(xiàn)遠端比近端神經(jīng)突部分（分支后）相關的 Aβ 包含更多的 Aβ-聚集體, 作者認為這些神經(jīng)元隔室可能本質(zhì)上更容易結合 Aβ或者能夠主動運輸?shù)竭h端,。

圖 4. 初級神經(jīng)元中 Aβ (1–42) 的結構成像。

總結：

新型成像方法FL-OPTIR 結合了熒光成像和紅外光譜來描述生物組織內(nèi)的結構變化。能夠針對復雜系統(tǒng)中的特定細胞,、細胞器和分子進行分析和檢測，解決了生物標本中紅外光譜定位困難的問題,。能夠直接在組織中定位和分析淀粉樣蛋白和相關的小膠質(zhì)細胞,，這可以解決局部環(huán)境在 AD 進展中的作用,，幫助識別與淀粉樣斑塊相關的小膠質(zhì)細胞，并在亞細胞水平上直接研究小膠質(zhì)細胞中的纖維結構,。為復雜樣品中的蛋白質(zhì)和細胞進行紅外光譜分析提供了新的測量方法,，為紅外在生物領域的應用提供更加便捷實驗途徑,。

作為美國PSC公司在中國的代理,，Quantum Design中國于2020年將非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)—mIRage系統(tǒng)引入國內(nèi),，助力中國科研工作者取得一個又一個重大突破：

國內(nèi)經(jīng)典案例分享：

南京大學環(huán)境學院借助mIRage建立了一種新型的塑料表面亞微米尺度化學變化表征方法。該工作發(fā)表在期刊Nature Nanotechnology上,。

中國農(nóng)業(yè)大學借助mIRage成功實現(xiàn)對玉米粉中痕量微塑料的原位可視化表征,。該工作發(fā)表在Science of the Total Environment上。

為滿足國內(nèi)日益增長的生物紅外表征需求，更好的為國內(nèi)科研工作者提供專業(yè)技術支持和服務,，Quantum Design中國北京樣機實驗室引進了熒光引導光學光熱紅外顯微光譜，為您提供樣品測試,、樣機體驗等機會,，期待與您的合作！ 

相關產(chǎn)品：

非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統(tǒng)—mIRage（生物領域）：http://sorrent.com.cn/st166724/product_33015211.html