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導讀

在生命科學的微觀世界里，纖維素作為植物和真菌細胞壁的關鍵構成要素,，其在單細胞層面的纖維素等多糖代謝研究一直是科學家們聚焦的重要領域。然而,，傳統(tǒng)成像技術在這一研究進程中卻遭遇了重重困境。傳統(tǒng)的紅外化學成像技術因分辨率的局限,，無法對單個細胞中的纖維素進行成像；而纖維素等多糖本身又難以被熒光標記,，這使得傳統(tǒng)熒光顯微鏡也很難在植物和真菌細胞內(nèi)的纖維素進行成像,。如此一來,，如何實現(xiàn)單細胞纖維素成像成為了該領域科研工作者亟待攻克的難題。

新型光學光熱紅外 (O-PTIR) 化學成像技術的蓬勃發(fā)展,，大幅提升了傳統(tǒng)紅外化學成像法的空間分辨率，在亞微米空間尺度上實現(xiàn)對不同物質進行特異性的無標記化學成像,。憑借該技術,，科研人員不僅可以對單個植物,、真菌細胞壁的纖維素等化學物質進行化學成像，還能通過紅外光譜分析纖維素等化學物質的變化來判斷該物質的生成或分解情況,，為科研工作者提供更加豐富的纖維素等多糖的代謝信息,。

新一代化學成像顯微鏡

美國PSC公司研發(fā)的新一代高分辨化學成像顯微鏡——mIRage,，大大地拓展了光學顯微鏡的應用,。mIRage不僅具備傳統(tǒng)熒光顯微鏡的熒光成像功能，還采用新型光學光熱紅外（O-PTIR）技術,，能夠對物質的分子結構進行無熒光標記的化學成像,，解決了傳統(tǒng)化學成像空間分辨率低的問題,，其化學成像分辨高達500 nm，可在亞微米尺度上對植物或真菌細胞壁的纖維素,、多糖等多種物質進行成像與波普分析。這為植物代謝組學,、植物細胞生物學等多個生命科學研究領域提供了新的表征手段。

突破傳統(tǒng),！高分辨化學成像顯微鏡,，點亮植物真菌單細胞纖維素成像研究新曙光

新一代高分辨化學成像顯微鏡——mIRage

突破傳統(tǒng),！高分辨化學成像顯微鏡，點亮植物真菌單細胞纖維素成像研究新曙光

mIRage的優(yōu)勢：

• 亞微米空間分辨的紅外光譜和拉曼高光譜成像（~500 nm）,；

• 與透射模式相媲美的反射模式下的圖譜效果；

• 非接觸測量模式—使用簡單快捷,，無交叉污染風險；

• 很少或無需樣品制備過程(無需薄片), 可測試厚樣品,；

• 可透射模式下觀察溶液中的樣品；

• 實現(xiàn)同時同地相同分辨率的IR和Raman測試,；

• 熒光顯微成像實現(xiàn)熒光標記樣品快速定位。

mIRage部分應用領域

一,、 mIRage助力植物細胞壁化學成像

在傳統(tǒng)植物細胞成像中，通過光學成像可以觀察到植物細胞壁的形貌特征,，但是普通光學顯微鏡很難對組成細胞壁的纖維素,、含羰基木質素、不含羰基木質素,、羰基化合物等成分進行成像,。而這些物質在細胞壁的內(nèi)的分布,、含量等信息對于植物代謝、根瘤研究等領域都有重要意義,。

下圖為mIRage對單個植物細胞的細胞壁進行的化學成像。通過對纖維素,、含羰基木質素,、不含羰基木質素,、羰基化合物等多種物質對應的紅外特征峰進行化學成像，可以得到整個植物細胞的細胞壁化學成像圖片,。可以清晰地表現(xiàn)出植物細胞壁的纖維素,、木質素分布,，并區(qū)分該木質素是否含有羰基,。

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下圖為mIRage對單個洋蔥上表皮細胞進行的化學成像,。其中左圖為洋蔥上皮細胞的光學成像與化學成像圖片,。mIRage對單個洋蔥上表皮細胞內(nèi)的氨基酸、水,、纖維素的特征峰進行了紅外化學成像,，可以明確地區(qū)分細胞壁與原生質體。同時可以對細胞特定區(qū)域分析紅外光譜,，獲得更加詳細的物質信息。

二、 mIRage協(xié)助分析番茄角質層化學性質與機械性能關系

角質層是一種多功能疏水性生物復合材料,，可保護植物的地上器官。在植物發(fā)育過程中,，植物角質層必須適應不同的機械約束，包括延展性和剛度,，而其化學成分,、結構異質性與機械性能的對應關系尚不清楚,。

科研人員深入研究了番茄 (Solanum lycopersicum) 果實角質層從早期發(fā)育到成熟的納米機械性能，以及與化學和結構異質性的關系,，發(fā)現(xiàn)在果實發(fā)育過程中，角質層結構發(fā)生了微調(diào),，并通過mIRage化學成像協(xié)助證明了這些局部區(qū)域機械性能與化學和結構異質性的梯度相關性,。

下圖為科研人員使用mIRage化學成像結合AFM表征的番茄開花后 25天（DPA）角質聚合物基質橫截面的信息，分析了從角質聚合物基質表面到表皮細胞表面的角質/多糖比率的梯度變化,。結果顯示，角質聚合物基質嵌入的多糖量對角質層的彈性模量有顯著影響,。脂質,、多糖和酚類化合物與角質聚合物基質彈性模量在每個發(fā)育階段都獲得了統(tǒng)計學上顯著的相關性。在結晶纖維素和果膠的彈性模量和拉曼強度之間觀察到正相關性,；相反，脂質和香豆酸的拉曼強度呈負相關,；同時發(fā)現(xiàn)番茄成熟后,，角質聚合物基質會積累酚類物質,。

為了闡明角質層聚合物中央溝的具體機械性能及其與角質聚合物基質化學成分和結構的關系,，在三個發(fā)育階段（即 20、30 和 40 DPA）借助mIRage比較了中央溝和溝的側面的化學成像信息（如下圖所示）,。20和30 DPA沒有明顯的角質信息,，拉曼數(shù)據(jù)直到 40 DPA 階段才顯示出中央溝的強的角質特定光譜指紋,，證明中央溝是由角質組成的，而多糖則逐漸被排除在側面,。溝邊的酚類化合物與結晶纖維素的相對積累也發(fā)生了變化,，而果膠則集中在中央溝邊,。上述數(shù)據(jù)表明，在番茄果實發(fā)育過程中,，角質聚合物基質中央溝的化學成分與溝邊略有不同。這些區(qū)域的脂質也觀察到具有不同的大分子排列,。

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三、 mIRage助力真菌細胞化學成像

除了植物細胞外,，mIRage還可以對真菌細胞進行化學成像。在一項針對能分解纖維素的外生菌根真菌Paxillus involutus研究中,，科研人員在纖維素薄膜上培養(yǎng)外生菌根真菌Paxillus involutus,，并對該真菌分解纖維素薄膜的過程進行了化學成像,。

下圖為mIRage對P. involutus菌絲尖進行的化學成像。圖C中可見纖維素背景,，寬度約為 4.6 µm（圖A中的綠色光譜和圖C中的綠色區(qū)域）,，以及菌絲周圍的纖維素分解區(qū),，該分解區(qū)從菌絲邊緣延伸約 6.3 µm（圖 A中的橙色光譜和圖C中的橙色區(qū)域）,。圖C中藍色區(qū)域顯示的是未受真菌分解影響區(qū)域的化學成像。圖B顯示了用 mIRage采集的被研究細胞的可見光圖像,。圖B中的紅色矩形表示用mIRage成像區(qū)域即為圖C區(qū)域。

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在圖A中的紅外光譜中,，1,100 cm^-1至 950 cm^-1波數(shù)區(qū)域的紅外信號在靠近菌絲處減小,；可以觀察到該碳水化合物區(qū)域內(nèi)光譜的明顯變化,。由于纖維素氧化導致的1,700 cm^-1至1,600 cm^-1紅外吸收的增加可以與細胞內(nèi)蛋白質肽鍵中C=O的變化導致的波普變化明顯區(qū)分開來，綜上數(shù)據(jù)表明：纖維素確實已被 P. involutus 氧化,。

四、 mIRage高分辨率表征真菌細胞纖維素代謝

mIRage的高空間分辨率和光譜質量有助于更好地觀察真菌纖維素分解區(qū)域化學物質的細微變化,，用于更進一步地表征真菌的纖維素代謝過程,。

下圖利用新一代高分辨化學成像顯微鏡——mIRage對圖A真菌的纖維素分解區(qū)進行了更加細致的波普分析：從菌絲的邊緣繪制一組徑向線（白色）,，并選擇靠近這些線的像素（338 個綠點）進行進一步分析。圖B顯示了沿其中一條徑向線上的不同采樣點（及圖A 中的不同色點）的單個光譜數(shù)據(jù),，表明纖維素分解區(qū)的紅外光譜發(fā)生了逐漸變化。經(jīng)過分析,，可以發(fā)現(xiàn)未改變的纖維素隨著距離菌絲的距離越遠,，含量越高（圖C中藍點）,，類似纖維素分解產(chǎn)物的含C = O化合物，隨著距離菌絲的距離越遠,，含量越低（圖C中橙色點）,。而且2種物質在距離菌絲一定距離后（超出真菌纖維素分解區(qū)）物質含量基本持平,。

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總結

在以上案例中,，mIRage展現(xiàn)了對單個植物細胞或真菌的化學成像能力。設備不僅可以對植物細胞壁中的纖維素進行成像,，也可以對植物細胞壁中的木質素、羰基化合物,、角質聚合物等多種物質進行特異性無標記成像,。而且,，在對真菌、植物細胞的化學成像過程中,，mIRage的高分辨率還可以對細小部位（真菌纖維素分解區(qū),、角質層聚合物中央溝）內(nèi)的同一物質的變化進行波普成像，更加準確地反饋特定物質的分布與化學變化,。我們希望該技術將助力植物代謝組學、真菌代謝組學,、植物學等領域的科研工作者做出重要貢獻,。

除了上述應用外,，mIRage這一熒光、紅外,、拉曼三合一的化學成像顯微還在多個科研領域有所應用：

1. 環(huán)境微塑料