支原體檢查培養(yǎng)基基本知識:
支原體(Mycoplasma)是細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的外源性污染物,,開展支原體污染檢測是細(xì)胞質(zhì)量控制微生物學(xué)安全性評價體系中的一項(xiàng)重要內(nèi)容,。由于活細(xì)胞制劑終產(chǎn)品不能滅菌處理,,被支原體污染后不像細(xì)菌或者真菌那樣容易被肉眼看見,所以在其培養(yǎng)時也很難被觀察,。因此需要適宜的支原體檢測方法,。目前,《中華人民共和國藥典》規(guī)定的支原體檢測方法培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法 (DNA染色法)是檢測支原體的“金標(biāo)準(zhǔn)",,能夠檢測不同生長特性的支原體,,具有廣譜性 。
環(huán)凱的精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基(貨號:MP01B/MP01BP)和精氨酸支原體半流體培養(yǎng)基(貨號:MP01S/MP01SP)可用于檢驗(yàn)利用精氨酸的支原體,,如口腔支原體等,,支原體肉湯培養(yǎng)基(貨號:MP02B/MP02BP)和支原體半流體培養(yǎng)基(貨號:MP02S/MP02SP)可用于檢驗(yàn)利用葡萄糖的支原體,如肺炎支原體等,。
支原體檢測培養(yǎng)基原理:
精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基:利用口腔支原體分解利用精氨酸產(chǎn)堿使得原本含酚紅的橙色培養(yǎng)基變?yōu)榧t色,。精氨酸支原體半流體培養(yǎng)基:直接培養(yǎng)口腔支原體于營養(yǎng)物質(zhì)充足的培養(yǎng)基中,觀察其生長及菌落生成,。支原體肉湯培養(yǎng)基:肺炎支原體通過葡萄糖代謝路徑利用葡萄糖產(chǎn)酸致使原本含酚紅的橙色培養(yǎng)基變?yōu)榈S色,。支原體半流體培養(yǎng)基:直接培養(yǎng)肺炎支原體接種于營養(yǎng)物質(zhì)充足的培養(yǎng)基中,觀察其生長及菌落生成,。
方法來源:
《中國藥典》2020年版 3301 支原體檢查法

靈敏度檢查(變色單位試驗(yàn)法)
器具:
→試管:螺口旋蓋試管,,利于培養(yǎng)時保持密閉;或者普通玻璃試管,,滅菌時使用硅膠塞,,培養(yǎng)時換成橡膠塞;或者培養(yǎng)時使用無菌液體石蠟液封,。
→新生牛血清或者馬血清
→生物安全柜,、生化培養(yǎng)箱等。
→培養(yǎng)基配制:
→基礎(chǔ)培養(yǎng)基:按標(biāo)簽所示配制方法制備,,分裝8 mL/支,,121℃滅菌15 min,待用,。
→完quan培養(yǎng)基:臨用前每支8 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2 mL新生牛血清或馬血清,。
※ 半流體培養(yǎng)基在使用前應(yīng)煮沸5~10 min,冷卻至55℃左右,,然后加入新生牛血清或馬血清,,充分搖勻。
→接種及培養(yǎng):選取變色的新鮮培養(yǎng)物,,接種至待檢培養(yǎng)基中,,做10倍系列稀釋,肺炎支原體稀釋至 10??~10??,,接種在支原體肉湯/半流體培養(yǎng)基內(nèi),;口腔支原體稀釋至 10?3~10??,,接種在精氨酸支原體肉湯/半流體培養(yǎng)基內(nèi)。每個稀釋度接種3 支試管,,置36±1℃密閉培養(yǎng)7?14天,,觀察培養(yǎng)基變色結(jié)果。
→結(jié)果判定:以接種后培養(yǎng)基管數(shù)的 2/3 以上呈現(xiàn)變色的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的靈敏度,。
→陽性案例展示
圖A:精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)結(jié)果,,左邊紅色為陽性右邊橙色為陰性;
圖B:精氨酸支原體半流體培養(yǎng)結(jié)果,,左邊有菌落懸浮為陽性,,右邊試管為陰性;
圖C:支原體肉湯培養(yǎng)結(jié)果,,左邊黃色為陽性,,右邊橙色為陰性;
圖D:支原體半流體培養(yǎng)結(jié)果,,左邊有菌落懸浮為陽性,,右邊試管為陰性。


注意事項(xiàng)
→靈敏度測定時,,支原體活化和傳代時建議做陰性對照,,肉眼觀察到明顯的顏色變化時,需盡快進(jìn)行傳代,,過度培養(yǎng)會導(dǎo)致支原體的活性明顯衰減,;
→半流體培養(yǎng)基煮沸融化時以全部溶解為宜,,過度加熱易導(dǎo)致營養(yǎng)損失,,接種時盡量在培養(yǎng)基未凝固,溫度約為37℃時接種支原體,;
→支原體凍存可以使用10%甘油,,凍干保護(hù)劑推薦選擇6%的蔗糖與1.5%的明膠。