小鼠抗平滑肌抗體（ASMA）ELISA試劑盒說明書

本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測定小鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中抗平滑肌抗體（ASMA）的含量,。

實驗原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中小鼠抗平滑肌抗體（ASMA）水平,。用純化的小鼠平滑肌抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被抗原的微孔中依次加入抗平滑肌抗體（ASMA）,，再與HRP標記的平滑肌抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的抗平滑肌抗體（ASMA）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中小鼠抗平滑肌抗體（ASMA）濃度。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。檢測細胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。

5. 組織標本：切割標本后,，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?/span>2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

操作步驟

1.         標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔,，在*、第二孔中分別加標準品100μl,，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl,，混勻,；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,，再在第三,、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別加到第五、第六孔中,，再在第五,、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻,；混勻后從第五,、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,，再在第七,、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九,、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，濃度分別為120IU/L，80IU/L ,，40IU/L,，20IU/L， 10IU/L）,。

2.         加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）、待測樣品孔,。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液50μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。

3.         溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。

4.         配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用,。

5.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。

6.         加酶：每孔加入酶標試劑50μl,，空白孔除外,。

7.         溫育：操作同3。

8.         洗滌：操作同5,。

9.         顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

10.     終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.     測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。

注意事項：

1．  試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

2．  濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果,。

3．  各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差,。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

4．  請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔,。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。

5．  封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。

6．  底物請避光保存,。

7．  嚴格按照說明書的操作進行,，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8．  所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9．  本試劑不同批號組分不得混用,。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準,。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標,，   

在坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD     

值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋      

倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標      

準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值      

代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋      

倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上,。

2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和15%

檢測范圍：                                             

3IU/L -150IU/L        

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：2-8℃,。

2．有效期：6個月