酶聯(lián)斑點（Elispot）實驗服務(wù)

酶聯(lián)斑點(Elispot) 技術(shù)概述：

酶聯(lián)斑點(Elispot) 全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測,，英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(即ELISA技術(shù)),， 能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況,。其技術(shù)原理，一句話概括就是:用抗體捕獲培養(yǎng)中的細胞分泌的細胞因子,，并以酶聯(lián)斑點顯色的方式將其表現(xiàn)出來,。

1、實驗的準(zhǔn)備工作

(1)設(shè)備與耗材:

①超凈工作臺;

②5% CO2 37°C細胞培養(yǎng)箱;

③P20,，P200,， P1000 微量移液器,

④P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器,

⑤Biosys ELISPOT Reader

⑥P20,，P200,， P1000 槍頭;

⑦多道移液器吸槽;

⑧0.5mL, 1.5mL EP管。

(2)溶液配制

①PBS:用分析純試劑,，Millipore級別的純水配制,， 高壓滅菌。

②PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意無菌操作,。儲存于20-25°C, 可存放一個月,。

③70%乙醇:分析純乙醇70mL，加入Millipore級別的純水至100mL,。

④30%乙醇:分析純2醇30mL,加入Millipore級別的純水至100mL.

⑤包被抗體(coating antibody, Primary antibody): 照U-Cytech說明書,，加入雙蒸水溶解。使用時,，用PBS稀釋50倍,，每孔50uL。

⑥封閉液:用PBS將試劑盒中的封閉存儲液(Blocking stock solution R)稀釋10倍,，每孔200uL,。

⑦抗體稀釋液:注意，只是用來稀釋檢測抗體和酶聯(lián)親和素,。用PBS將試劑盒中的稀釋存儲液(Dilutionbuffer R)稀釋10倍

⑧檢測抗體(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):照U-Cytech說明書,， 加入雙蒸水溶解。使用時,，用抗體稀釋液稀釋100倍,，每孔100uL。

⑨酶聯(lián)親和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech說明書,，加入雙蒸水溶解,。使用時，用抗體稀釋液稀釋100倍,，每孔100uL,。

D AEC顯色液: 照U-Cytech說明書， 用100mL 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC儲存液(AEC stock solution),混合均勻后10ml每支分裝，-200C保存,。

使用時,，解凍，每孔加入100pL.

①PHA刺激物:將儲存液(2mg/ml,，Murex)分裝成20μL/EP管,， -20*C長期凍存。 使用時,，加入980μLU-Cytech無血清培養(yǎng)基(或者1640基本培養(yǎng)基),成為工作液(40μg/mL,，10倍終濃度)，每孔加入10μL, 終濃度4μg/mL,。

②U-Cytech無血清培養(yǎng)基:我們推薦無血清ELISPOT技術(shù),，它能排除血清的干擾，結(jié)果更加穩(wěn)定可靠,背景也更好,。如果沒有,，可以用含10%血清的1640培養(yǎng)基代替。

2,、ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序

(1)第—天: ELISPOT包被程序設(shè)計好試驗,，把每個孔要加入的內(nèi)容做成卡片，到時候就會從容很多,。每孔加入15μL 70%的醇預(yù)濕30秒,。

注意:

①未潤濕的PVDF膜是潔白的、不透明的,，經(jīng)過乙醇潤濕之后,，顏色變暗，變成半透明狀,，很容易觀察二者的區(qū)別。

②加乙醇的時候,，槍頭應(yīng)該靠在孔壁接近孔底的地方,，注意槍頭不到刺到PVDF膜。

③有時候,，加入的乙醇掛在孔壁上,， 這時要蓋上板蓋，輕輕叩擊,，讓乙醇順勢滑落,。乙醇一 旦接觸到PVDF膜，就會在表面張力和毛細作用之下迅速浸潤整塊膜,，使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化,。

④15μL 是經(jīng)過優(yōu)化的體積，它能保證剛好*浸潤整塊膜，而不會有剩余,。如果加大使用量,，乙醇溶液就會透過膜而積存在膜的背面,加深實驗的背景。

⑤加入100μL去離子水洗滌三次,，盡量減少乙醇的殘留,。

⑥按照試劑盒的使用說明，將包被抗體儲存液稀釋在PBS緩沖液中,，每孔加入50μL,，4°C包被過夜。

⑦(次日)傾倒包被液,，用PBS洗滌5次,，后一次，在滅菌的吸水紙上扣干,。

⑧加入200μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液,，37°C封閉1小時。

⑨傾倒封閉液,，無須洗滌,，直接可以進行細胞培養(yǎng)。(也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌- -次, 拍干,封口,，4°C保存,，可以在4°C保存數(shù)周。)

(2)第二天:鋪細胞,，加入刺激物,，培養(yǎng)

①整個實驗設(shè)置-組正對照(PHA刺激), 每一個細胞樣品(同-個捐獻者或者實驗動物)要設(shè)一個負(fù)對照

(不加刺激物)，整塊板還要加一個背景負(fù)對照(不含細胞,，只加培養(yǎng)基和所有的檢測試劑),。

②填好實驗卡片，用以指導(dǎo)實驗的安排和細胞及試劑的添加,。每一個細胞/刺激物的組合設(shè)置2-4個孔的重復(fù)(想要有統(tǒng)計學(xué)的意義,，每個細胞/刺激物設(shè)4個孔的重復(fù))。

④取出封閉好的板,，準(zhǔn)備加入細胞,。如果是以前做的封閉，可以加入200μL 的U-Cytech無血清培養(yǎng)基,室溫靜置10分鐘,，傾倒,，然后再重復(fù)- -次。

⑤按照實驗卡片的安排,，加入不同濃度的細胞,，100uLwell, 細胞在孔中的分布要盡量均勻(要訣是加入

細胞之后,，不要再震動或者拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會讓細胞更分散,，實際情況剛好相反),。正對照的細胞濃度為1x105/well,實驗組的樣品細胞濃度請自行調(diào)整。

⑥加入100μL的U-Cytech無血清培養(yǎng)基到背景負(fù)對照孔,。

⑦正對照孔加入10μL PHA,終濃度4ug/mL,該濃度能有效刺激IFN-V的分泌,。

⑧加入實驗者自己的刺激物(配制成10X終濃度，10uLwell)到實驗孔,。 加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板,。有人認(rèn)為拍擊板子會讓刺激物在孔中混合均勻，實際上,，通過擴散,，刺激物也會很快混合均勻。拍擊板子會讓細胞成圈的分布在孔的外周,。

⑨當(dāng)加完所有的樣品之后,，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱,，37°C培養(yǎng)18-24小時,。 注意在整個培養(yǎng)過

程中避免移動、碰撞培養(yǎng)板,。為了取得更好的結(jié)果,，甚至開關(guān)培養(yǎng)箱的箱[ ]也應(yīng)該禁止。因為碰撞會造成細胞的移位,，造成斑點的模糊,、拖尾。

(3)第三天:培養(yǎng)后操作

①傾倒孔內(nèi)的細胞及培養(yǎng)基,。

②低滲法將細胞裂解,，每孔加入200μL冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘,。

③每孔用200μLPBST洗滌10遍,，洗滌后- 遍之后,將板倒扣在吸水紙上拍干。

④按照試劑盒說明的濃度,，用抗體稀釋液稀釋檢測抗體，每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測抗體,37°C 1小時,。

⑤每孔用200μL PBST洗滌5遍,，洗滌后一遍時， 將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下,，同時洗滌膜的正反兩面,，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干。

注意:

①洗滌膜的背面,，我們摸索出的辦法是,，在-個淺托盤中盛上干凈的PBST,將膜板的底面浸入，輕輕搖晃幾次即可,。注意,，-定要將膜的背面和塑料保護層上的液體甩干之后，再合攏,，蓋上,，不要傷害到膜。

②按照試劑盒說明的濃度,，用抗體稀釋液稀釋酶標(biāo)的鏈霉親和素,，每孔加入100L, 37°C 1小時。

③每孔用200μL PBST洗滌5遍,， 洗滌后-遍時,，將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面,，蓋上保護層,，將板倒扣在吸水紙上拍干。

④照試劑盒的說明,，解凍已配好的AEC顯色液,。每孔加入100μL的顯色液，室溫靜置20-30分鐘,，注意避光,。

⑤待斑點生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍,，終止顯色過程,。將板倒扣在吸水紙上,拍干細小的水珠，之后取下保護層,，放在通風(fēng)的地方,，室溫靜置10-30分鐘，讓膜自然晾干,。注意不要將板放到烤箱內(nèi),，防止膜發(fā)脆、破裂,。

⑥將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動讀板儀內(nèi),調(diào)節(jié)好合適的參數(shù),，半點計數(shù),并記錄斑點的各種參數(shù)，作統(tǒng)計分析,。

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