AxyPrep 無內(nèi)毒素質粒大量試劑盒

本試劑盒采用 SDS 堿裂解法,，結合 DNA 制備膜選擇性吸附 DNA,。同時采用特殊溶液（Buffer ETR 和 Buffer PF）有效去除內(nèi)毒素,，可從 80-200 ml 細菌培養(yǎng)物中提取出多至 500 礸 高純度質粒 DNA，其內(nèi)毒素水平控制在 0.1 EU/礸 以下,。

一,、 試劑盒組成,、貯存,、穩(wěn)定性

RNase A：50 mg/ml,，室溫可貯存 6 個月，長期貯存于-20℃,。
Buffer S1：細菌懸浮液,。加入 RNase A 后，混合均勻,，4℃貯存,。
Buffer S2：細菌裂解液（含 SDS/NaOH），室溫密閉貯存,。
Buffer S3K：中和液,，室溫密閉貯存。
Buffer B：DNA 結合溶液,，室溫密閉貯存,。
Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存,。
Buffer W2 concentrate：去鹽液,。使用前，按試劑瓶上的體積加入無水乙醇（可用無水乙醇或 95%
乙醇）,?；旌暇鶆颍覝孛荛]貯存,。
ET-free water (70% Ethanol)：使用前,，按試劑瓶上的體積加入無水乙醇（可用無水乙醇或 95%
乙醇）。混合均勻,，室溫密閉貯存,。
Eluent A：洗脫液。室溫密閉貯存,。
Buffer ETR：內(nèi)毒素去除液,。室溫密閉貯存。

二,、 注意事項

1.細菌過量將影響細菌裂解,、質粒 DNA 的釋放，導致內(nèi)毒素含量過高,。

2.步驟 3 和步驟 4 的操作必須溫和,。劇烈搖晃將導致基因組 DNA 的污染。但混合必須充分,，否則影響得率,。

3.在加入 Buffer S3K 時，蛋白質和基因組 DNA 形成粘稠的白色絮狀沉淀,，必須充分混合均勻,，使凝集塊中間也得到充分中和凝結。

4.Buffer S2,、Buffer S3K,、Buffer B 和 Buffer W1 含刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套和防護眼鏡,，避免沾染皮膚,、眼睛和衣物，謹防吸入口鼻,。若沾染皮膚,、眼睛時，要立即用大量清水或生理鹽水沖洗,，必要時尋求醫(yī)療咨詢,。

三、 實驗準備

1.*次使用前,，RNase A 全部加入 Buffer S1 中,，4℃貯存。

2.*次使用前,，Buffer W2 concentrate 中加入體積的無水乙醇,。

3.*次使用前，ET-free water (70% Ethanol)中加入體積的無水乙醇,。使用前置于-20℃預冷,。

4.使用前,，檢查 Buffer S2 是否出現(xiàn)沉淀，如出現(xiàn)沉淀,，應于 37℃溫浴加熱溶解并冷卻至室溫后使用,。

5.Eluent A 在 65℃預熱后使用，有利于提高質粒得率,。

6.Buffer S3K,、Buffer B 和 Buffer ETR 使用前置于 4℃預冷。

7.準備無核酸和核酸酶污染的 Tip 頭,、50ml 離心管,。

8.水平離心機（轉速可達到 4,000×g）及冷凍離心機（轉速可達到 8,000×g）

9.準備 56℃水浴。

Buffer PF：分相緩沖液,。室溫密閉貯存,。

四、 操作步驟

AxyPrep無內(nèi)毒素質粒大量試劑盒

1.取 80-200 ml 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液（若使用豐富培養(yǎng)基,，菌液體積應減半或更少）,，3,000 ×g 離心 8 min，棄上清,。將離心管倒置于紙巾上 1 min,，除盡上清。
一般過一夜培養(yǎng)的菌液 OD600 在 2.0-4.0 之間,。若菌液 OD600 >4,，菌量需減少。

2.加 10 ml Buffer S1,，懸浮細菌沉淀，懸浮需均勻,，不應留有小的菌塊,。

確認 Buffer S1 中已加入 RNase A。

3.加 10 ml Buffer S2,，溫和并充分地上下翻轉混合均勻使菌體充分裂解,，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過 5 min,。
Buffer S2 使用后立即蓋緊瓶蓋,，以免空氣中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率,。
避免劇烈搖晃,，否則將導致基因組 DNA 污染。
此步驟不宜超過 5 min,。

4.加 10 ml 4℃預冷的 Buffer S3K,，溫和并充分地上下翻轉混合,，直至溶液顏色均一并形成緊實的凝集塊，室溫放置 5 min,。
加入 Buffer S3K 后應立即混合,，以避免形成局部的凝結塊。

避免劇烈搖晃,，否則將導致基因組 DNA 污染,。

5.加 10 ml 4℃預冷的 Buffer B，溫和并充分地上下翻轉混合 10 次,，8,000×g 離心（4℃）10 min,。

步驟 6-9 可以選擇離心法或負壓法。

A.離心法：

6A. 先將大量制備管放入 50 ml 離心管中,。吸取步驟 5 中的混合液,，轉移到大量濾器（Maxiprep

syringe filter）中。

7A. 插入推桿,，垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,，≥6,000×g 離心 5 min。 8A. 棄濾液,，加 12 ml Buffer W1 至制備管中,，≥6,000×g 離心 5 min。
9A. 棄濾液,，加 14 ml Buffer W2 至制備管中,，≥6,000×g 離心 5 min。

確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇,。

B.負壓法：

6B. 正確連接負壓裝置,，將大量制備管插到負壓裝置的插口上。

7B. 吸取步驟 5 中的上清液,，轉移到大量濾器中,，插入推桿，垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,，開啟并調節(jié)負壓至-25 ~ -30 英寸汞柱,，緩慢吸走管中溶液。

8B. 保持負壓,，加 12 ml Buffer W1,，吸盡管中溶液。

9B. 保持負壓,，加 14 ml Buffer W2,，吸盡管中溶液。

確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇,。

10.再在大量制備管中加 4 ml Buffer W2,，≥6,000×g 離心 5 min,。

11.將制備管置于另一潔凈 50 ml 離心管中，在制備管膜中央加 2 ml Eluent A,，室溫靜置 5 min,，≥6,000

×g 離心 5 min 收集質粒 DNA。

將 Eluent A 加熱至 65℃將提高洗脫效率,。

12.棄制備管,。在濾液中加入 4 ml 預冷的 Buffer ETR，混合均勻,。

如果 Buffer ETR 渾濁,，于冰上靜置，直至溶液變得清亮,；如果分層,，則混合均勻。

13.加入 1 ml Buffer PF,，混合均勻,。

*溶液可能會出現(xiàn)微弱的渾濁現(xiàn)象，此為正?，F(xiàn)象,。

14.置于 56°C 孵育 8 min。室溫 4,000×g 離心 5 min,。

孵育后溶液將出現(xiàn)大量乳白色沉淀,，否則延長孵育時間。

孵育后溶液有可能出現(xiàn)分層現(xiàn)象,，此為正?，F(xiàn)象。
此步驟的離心必須使用吊籃式（swing-out rotor）離心機或其他水平離心機

15.取無色上相至 50 ml 離心管中,，加入 0.8 倍體積異丙醇（如：取得 6 ml 無色上相,，則加入 4.8 ml 異丙醇），混合均勻,。室溫靜置 10 min。8,000×g 離心 10 min,。
16.盡可能棄盡上清,。加入 2 ml 預冷的 ET-free water（70% Ethanol），洗滌沉淀,，8,000×g 離心 5 min,。

ET-free water（70% Ethanol）使用前確定已加入體積的無水乙醇。

AxyPrep無內(nèi)毒素質粒大量試劑盒

17.盡可能棄盡上清,。在超凈臺中干燥 10-15 min,。

管壁上殘留液體可短暫離心后吸棄,。

18.加入 500 祃 Eluent A 或無內(nèi)毒素水溶解質粒 DNA。

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