慶大霉素快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法,,在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原,,樣本中的殘留物慶大霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗慶大霉素抗體,加入酶標記物后,,用 TMB 底物顯色,,樣本吸光值與其所含殘留物慶大霉素的含量成負相關,與標準曲線比較即可得出相應殘留物慶大霉素的含量,。
二,、試劑盒特性
- 試劑盒靈敏度: 0.05ppb
u 孵育溫度: 25℃
u 孵育時間: 30min~15min
- 樣本檢測下限
組織 ············································ | 2.5 ppb | |
肝臟 | ·············································· | 3 ppb |
牛奶 | ·············································· | 3 ppb |
- 交叉反應率
慶大霉素 | ······································ | 100% |
鏈霉素 | ······································· | <1% |
雙氫鏈霉素 ········································ | <1% | |
新霉素 | ·········································· | <1% |
- 樣本回收率
組織 ······································ 90%±20%
肝臟 ······································ 80%±20%
牛奶 ······································· 90%±18%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條 8 孔,,一板 12 條 | |
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| 標準液×6 瓶 | 0ppb | 0.05ppb |
2 | 0.15ppb | 0.45ppb | |
(1ml/瓶) | |||
| 1.35ppb | 4.05ppb | |
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3 | 酶標記物 | 7ml | 紅色帽 |
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4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍色帽 |
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5 | 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 |
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6 | 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
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7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
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8 | 20X 濃縮洗滌液 | 15ml | 白色帽 |
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9 | 樣本復溶液 | 50ml | 透明帽 |
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10 | 10x 濃縮提取液 | 50ml | 藍色帽 |
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四,、所用儀器、試劑
具備的儀器:酶標儀,、均質器,、振蕩器、離心機,、刻度移液管,、天平(感量 0.01g)、恒溫箱
微量移液器:單道 20~200µl,、單道 100~1000µl,、
多道 30~300 µl
五、樣本前處理步驟
- 樣本處理前須知
(a)實驗中必須使用一次性吸頭,,吸取不同試劑時要更換吸頭,。
(b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,必要時可對實驗器具進行清潔,,以避免污染干擾實驗結果,。
- 樣本前處理需配制:配液 1 樣本提取液:
- 10X 濃縮提取液用去離子水按 1:9 稀釋。
- 樣本處理:
(a)組織(雞肉,、豬肉,、魚肉、蝦)、肝臟(雞肝,、豬肝)樣本處理方法
1,、取 1±0.05g 去除脂肪的粉碎樣本,加入 5ml 樣本提取液,,振蕩 3min,;4000r/min,室溫離心
10min,;2,、取 50µl 上清液,加入 450µl 樣本復溶液混勻,,
混合 30s,;3、取 50µl 用于分析,。
樣本稀釋倍數(shù):50
(b) 牛奶樣本處理方法
1,、取 0.5ml 均質的牛奶樣本,加入 2ml 樣本提取
液,,振蕩 2min,;4000r/min,室溫離心 5min,;2,、取 50µl 上清液,加入 450µl 樣本復溶液混勻,,
混合 30s;3,、取 50µl 用于分析,。
樣本稀釋倍數(shù):50
六、酶標免疫分析程序:
- 測定前應須知:
1,、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫
(20~25℃),。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2~8℃,。
3,、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的*性,,正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點,。
4、 所有恒溫孵育過程,,避免光線照射,,用蓋板膜蓋住微孔板。
- 操作步驟:
1、從 2~8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,,室溫(20~
25℃)平衡 30min 以上,,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2,、取出框架及需要數(shù)量的微孔,,將不用的微孔放
入自封袋,保存于 2-8℃,。
3,、配液:將 15ml 濃縮洗滌液(20 倍濃縮)用去離子水按照 1:19 稀釋(1 份濃縮洗滌液+19 份
去離子水),或按所需用量配制洗滌液,。4,、編號:將樣本和標準品對應微孔按序編號,每
個樣本和標準品做 2 孔平行,,并記錄標準孔和樣本孔所在的位置,。
5、加標準品/樣品 50µl/孔到各自的微孔中,,加入酶標記物 50µl/孔,,然后再加入抗體工作液 50µl/ 孔,用蓋板膜封板,,25℃環(huán)境中反應 30min,。
6、將孔內液體甩干,,用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4~5 次,,每次間隔 15~30 秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破),。
7,、顯色:加入底物 A 液 50µl/孔,再加入底物 B 液 50µl/孔,,輕輕振蕩混勻,,25℃環(huán)境中避光顯色 15min,。
8,、測定:加入終止液 50µl/孔,,輕輕振蕩混勻,設定酶標儀于 450nm 處(建議用雙波長 450/630n m 檢測,,5min 內讀數(shù)),,測定每孔 OD 值。
七,、結果判定
結果判定有兩種方法,,粗略判定可用第 1 種方法,定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含慶大霉素量成負相關,。
1,、粗略判定:
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3,,樣本 2 的吸光度值為 1.0,,標準液吸光度值分別是:
0ppb 為 2.243;0.05ppb 為 1.816,;0.15ppb 為 1.415,; 0.45ppb 為 0.74;1.35ppb 為 0.313,;4.05ppb 為 0.155,。則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb~4.05ppb;樣本 2
的濃度范圍是 0.15ppb~0.45ppb,,乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實際濃度,。
2、定量分析
(1)百分吸光率的計算,,標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以*個標準(0 標準)的吸光度值,,再乘以 100%,即
B
百分吸光率(%)= ×100%
B0
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值
(2)標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標,,以慶大霉素標
準品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標,,繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,,從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,,乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,,更便于大量樣本的準確,、快速分析。
八,、 注意事項
1、室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫(20~
25℃)會導致所有標準的 OD 值偏低,。
2,、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標準曲線不成線性,,重復性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3,、混合要均勻,,否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
4、反應終止液為 2M 硫酸,,避免接觸皮膚,。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒,;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD 值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑,。
6,、不用的微孔板放進自封袋重新密封;標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感,,因此要避免直接暴露在光線下,。
7、顯色液若有任何顏色表明變質,,應當棄之,。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時,表示試劑可能變質,。
8,、該試劑盒理想反應溫度為 25℃,溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。
九,、儲藏條件和保質期
1、儲藏條件:試劑盒于 2~8℃保存,,不要冷凍,。
2、保 質 期:該產品有效期為 1 年,,生產日期見包裝盒,。
提示:酶標板真空包裝袋若有漏氣,酶標板仍然正常有效,,不影響實驗結果,,請放心使用。