慶大霉素快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法,，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的殘留物慶大霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗慶大霉素抗體，加入酶標記物后,，用 TMB 底物顯色,，樣本吸光值與其所含殘留物慶大霉素的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物慶大霉素的含量,。

二,、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：  0.05ppb

u 孵育溫度： 25℃

u 孵育時間： 30min～15min

• 樣本檢測下限

• 交叉反應率

• 樣本回收率

組織 ······································ 90%±20%

肝臟 ······································ 80%±20%

牛奶 ·······································   90%±18%

三、試劑盒組成

四,、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀,、均質器,、振蕩器、離心機,、刻度移液管,、天平（感量 0.01g）、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl,、單道 100～1000µl,、

多道 30～300 µl

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時要更換吸頭,。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔,，以避免污染干擾實驗結果,。

• 樣本前處理需配制：配液 1 樣本提取液：

• 10X 濃縮提取液用去離子水按 1：9 稀釋。

• 樣本處理：

（a）組織（雞肉,、豬肉,、魚肉、蝦）、肝臟（雞肝,、豬肝）樣本處理方法

1,、取 1±0.05g 去除脂肪的粉碎樣本，加入 5ml 樣本提取液,，振蕩 3min,；4000r/min，室溫離心

10min,；2,、取 50µl 上清液，加入 450µl 樣本復溶液混勻,，

混合 30s,；3、取 50µl 用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù)：50

（b） 牛奶樣本處理方法

1,、取 0.5ml 均質的牛奶樣本，加入 2ml 樣本提取

液,，振蕩 2min,；4000r/min，室溫離心 5min,；2,、取 50µl 上清液，加入 450µl 樣本復溶液混勻,，

混合 30s；3,、取 50µl 用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù)：50

六、酶標免疫分析程序:

• 測定前應須知：

1,、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫

（20～25℃）,。

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃,。

3,、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性,，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點,。

4、 所有恒溫孵育過程,，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,，室溫（20～

25℃）平衡 30min 以上,，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2,、取出框架及需要數(shù)量的微孔,，將不用的微孔放

入自封袋，保存于 2-8℃,。

3,、配液：將 15ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份

去離子水），或按所需用量配制洗滌液,。4,、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每

個樣本和標準品做 2 孔平行,，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置,。

5、加標準品/樣品 50µl/孔到各自的微孔中,，加入酶標記物 50µl/孔,，然后再加入抗體工作液 50µl/ 孔，用蓋板膜封板,，25℃環(huán)境中反應 30min,。

6、將孔內液體甩干,，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次,，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。

7,、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯色 15min,。

8,、測定：加入終止液 50µl/孔,，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測,，5min 內讀數(shù)）,，測定每孔 OD 值。

七,、結果判定

結果判定有兩種方法,，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含慶大霉素量成負相關,。

1,、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3,，樣本 2 的吸光度值為 1.0,，標準液吸光度值分別是：

0ppb 為 2.243；0.05ppb 為 1.816,；0.15ppb 為 1.415,； 0.45ppb 為 0.74；1.35ppb 為 0.313,；4.05ppb 為 0.155,。則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2

的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb,，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實際濃度,。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算,，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準（0 標準）的吸光度值,，再乘以 100%，即

B

百分吸光率（%）＝ ×100%

B₀

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B₀—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標,，以慶大霉素標

準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標,，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,，更便于大量樣本的準確,、快速分析。

八,、 注意事項

1、室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～

25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低,。

2,、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性,，重復性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3,、混合要均勻,，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。

4、反應終止液為 2M 硫酸,，避免接觸皮膚,。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒,；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑,。

6,、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感,，因此要避免直接暴露在光線下,。

7、顯色液若有任何顏色表明變質,，應當棄之,。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質,。

8,、該試劑盒理想反應溫度為 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

九,、儲藏條件和保質期

1、儲藏條件：試劑盒于 2～8℃保存,，不要冷凍,。

2、保 質 期：該產品有效期為 1 年,，生產日期見包裝盒,。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效,，不影響實驗結果,，請放心使用。

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