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四環(huán)素快速檢測(cè)試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 方法,，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的殘留物四環(huán)素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗四環(huán)素抗體，加入酶標(biāo)記物后,，用 TMB 底物顯色,，樣本吸光值與其所含殘留物四環(huán)素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物四環(huán)素的含量,。

二,、試劑盒特性

試劑盒靈敏度： 0.05ppb

u	孵育溫度：	25℃
u	孵育時(shí)間：	30min～15min
u	樣本檢測(cè)下限

雞肉樣本：
四環(huán)素 ···········································	0.4ppb
二甲按胺四環(huán)素 ··································	0.4ppb
吡四環(huán)素 ········································	0.4ppb
金霉素 ········································	0.4ppb
脫甲基金霉素 ·································	1.2ppb
土霉素 ··········································	0.8ppb
強(qiáng)力霉素 ·······································	1ppb
豬肉、蜂蜜樣本：
四環(huán)素 ··········································	0.5ppb
二甲按胺四環(huán)素 ·································	0.5ppb
吡四環(huán)素 ······································	0.5ppb
金霉素 ·········································	0.5ppb
脫甲基金霉素 ································	1.5ppb
土霉素 ···········································	1ppb
強(qiáng)力霉素 ········································	1.2ppb

交叉反應(yīng)率

四環(huán)素 ·········································· 100%

二甲按胺四環(huán)素 ································· 125%

吡四環(huán)素 ·······································	110%
金霉素 ···········································	100%
脫甲基金霉素 ···································	35%
土霉素 ············································	58%
強(qiáng)力霉素 ·········································	45%

樣本回收率

雞肉,、豬肉,、蜂蜜 ···························· 85±20%

三、試劑盒組成

1	微量測(cè)試孔	每條 8 孔,，一板 12 條

2	標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液	1ml	黑色帽
2	（81ppb）	1ml	黑色帽

3	高濃度標(biāo)準(zhǔn)品	1ml	黑色帽
3	（100ppb）	1ml	黑色帽

4	酶標(biāo)記物	7ml	白色帽

5	抗體工作液	7ml	白色帽

6	底物 A 液	7ml	白色帽

7	底物 B 液	7ml	黑色帽

8	終止液	7ml	黃色帽

9	20X 濃縮洗滌液	15ml	白色帽

10	10X 樣本提取液	50ml*2	透明帽

11	標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液	15ml*2	藍(lán)色帽

四,、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀,、均質(zhì)器,、振蕩器、離心機(jī),、刻度移液管,、天平（感量 0.01g）、恒溫箱

微量移液器：?jiǎn)蔚?20～200µl,、單道 100～1000µl,、

多道 30～300 µl

試劑：甲醇

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭,。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,，

必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)				3,、在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于
驗(yàn)結(jié)果。				洗板的*性,，正確的洗板操作是 ELISA 測(cè)定
u	樣本前處理需配制：			程序中的要點(diǎn),。
配液 1		樣本提取液 A		4、所有恒溫孵育過程,，避免光線照射,，用蓋板膜
		用去離子水450ml 與50ml 10X 樣本提取液		蓋住微孔板。
		混勻或按 9：1 的比例按需配制（如 10X		u 操作步驟：
		樣本提取液有結(jié)晶,，需溶解后在進(jìn)行稀		1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,，室溫（20～
		釋）,。		25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使
配液 2		樣本提取液 B		用前均須搖勻,。
		取甲醇 50ml 與 450ml 樣本提取液 A 混勻		2,、配制標(biāo)準(zhǔn)品
		或按 1：9 的比例按需配制。		標(biāo)準(zhǔn)品 6：50µl 標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液（81ppb）用 950µl
配液 3		樣本提取液 C		標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液稀釋	4.05ppb
		取甲醇 100ml 與 270ml 樣本提取液 A 混勻		標(biāo)準(zhǔn)品 5：600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 6
		或按 10：27 的比例按需配制,。		混合	1.35ppb
u	樣本處理：			標(biāo)準(zhǔn)品 4：600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 5
（a）雞肉處理方法				混合	0.45ppb
1,、稱取 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中，				標(biāo)準(zhǔn)品 3：600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 4
	加入 8ml 樣本提取液 A（見配液 1）,，振蕩 3min,，			混合	0.15ppb
	室溫 4000r/min 以上，離心 10min,；			標(biāo)準(zhǔn)品 2：600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 3
2,、取 50 上清液用于分析				混合	0.05ppb
	樣本稀釋倍數(shù): 8 倍			標(biāo)準(zhǔn)品 1：標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液	0ppb
（b）豬肉處理方法				3、取出框架及需要數(shù)量的微孔,，將不用的微孔放
1,、稱取 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中，				入自封袋,，保存于 2-8℃,。
	加入 10ml 樣本提取液 B（見配液 2），振蕩 3min,，			4,、配液：將 15ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去
	室溫 4000r/min 以上，離心 10min,；			離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份
2,、取 50 µl 上清液用于分析				去離子水）,，或按所需用量配制洗滌液。
	樣本稀釋倍數(shù): 10 倍			5,、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),，每
（c）蜂蜜處理方法				個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和
1,、稱取 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中,，				樣本孔所在的位置。
	加入10ml 樣本提取液C（見配液3）,，振蕩3min,，			6、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中,，然后加
	室溫 4000r/min 以上,，離心 10min；			加入酶標(biāo)記物 50µl/孔再加入抗體工作液 50µl/
2,、取 50 µl 上清液用于分析				孔,，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻,。25℃環(huán)境
	樣本稀釋倍數(shù): 10 倍			中反應(yīng) 30min,。
				7、將孔內(nèi)液體甩干,，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔
六,、酶標(biāo)免疫分析程序:
				洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒,，用吸水紙
u	測(cè)定前應(yīng)須知：

1,、使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫			拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺

（20～25℃）。			破）,。
			8,、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B
2,、使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃,。
			液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯

色 15min,。

9、測(cè)定：加入終止液 50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長(zhǎng) 450/630n m 檢測(cè)，5min 內(nèi)讀數(shù)）,，測(cè)定每孔 OD 值,。

七,、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法,，定量判定用第 2 種方法,。注意樣本吸光度值與其所含四環(huán)素量成負(fù)相關(guān)。

1,、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0,，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：

0ppb 為 2.243,；0.05ppb 為 1.816；0.15ppb 為 1.415,； 0.45ppb 為 0.74,；1.35ppb 為 0.313；4.05ppb 為 0.155,。

則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb,；樣本 2

的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素實(shí)際濃度,。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算,，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值,，再乘以 100%，即

百分吸光率（%）＝ ×100%

B₀

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B₀—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),，以四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)

品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析。

八,、注意事項(xiàng)

1,、室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～

25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。

2,、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作,。

3,、混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。

4,、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚,。

5,、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度,、OD 值變化,；不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6,、不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封,；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下,。

7,、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之,。標(biāo)準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時(shí),，表示試劑可能變質(zhì)。

8,、該試劑盒理想反應(yīng)溫度為 25℃,，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九,、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期