人KI-67免疫組化試劑盒
該試劑盒以HRP標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物（HRP Streptavidin Conjugate,，HRP-SA）為基礎(chǔ)，可用于檢測細(xì)胞,、組織內(nèi)的特異性KI-67抗原,。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng),、定性定位準(zhǔn)確,、背景清晰。在所用的KI-67一抗與相應(yīng)靶抗原結(jié)合后,，用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合,，后加入HRP-SA，形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA復(fù)合物,，顯微鏡下觀察成像,。
注：本產(chǎn)品僅供實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究。本步驟是根據(jù)我們長期實(shí)驗(yàn)得出的有效步驟,，請客戶根據(jù)具體科研實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化,，并歡迎客戶和我們探討。
試劑盒所含試劑：
試劑A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（選用）
試劑B 封閉緩沖液（封閉用） 20 mL
試劑C （*分裝）已稀釋的即用型KI-67一抗（2.5ml）
試劑D （*分裝）生物素化羊抗兔IgG 1支
（濃度1.5 mg/mL,，稀釋比為1:300~1:500）50 μL+抗體稀釋液20ml
試劑E HRP-SA復(fù)合物1支（濃度1 μM,，稀釋比1:50~1:200）100 μL
試劑F DAB顯色液 5ml
用戶自備試劑：
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三羥基氨基甲完烷1.21g
氯化鈉7.6g
加蒸餾水800mL，濃鹽酸調(diào)pH值至7.2~7.4,，后定容至1000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）
2．抗原修復(fù)液（依檢測抗原不同而選擇不同的修復(fù)液）
10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液
檸檬酸0.38g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水900mL,，濃鹽酸調(diào)pH值至6.0，后定容至1000mL
或：0.5M EDTA修復(fù)液（pH8.0）
EDTA·2H2O 186.1g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水700mL,，用10mM NaOH調(diào)pH值至8.0,，后定容至1000Ml
3. 緩沖甘油封固劑10 mL
4. Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片免疫染色
實(shí)驗(yàn)步驟（建議方案）：
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr,；
2.脫蠟： 切片放入盛有二甲本苯的容器中脫蠟3次（即二甲本苯Ⅰ,、Ⅱ、Ⅲ）,，每次10 min,；
3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化,，無水乙醇5min,，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min,；75%乙醇2min,，自來水沖洗,，ddH2O洗2×2min；
4.抗原修復(fù)： 根據(jù)抗體說明書推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù),，常采用高壓,、微波（溫度達(dá)到98~100℃）或酶消化修復(fù)法，室溫自然冷卻,，自來水沖洗,，ddH2O洗2×2min，TBS洗滌（2×2min）（具體修復(fù)方法見附1）* 注：有些抗原勿需修復(fù),，直接進(jìn)入第5步封閉,。
5.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min,；
6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗）,，37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過夜；
7.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）,；
8.封閉： 滴加試劑B,，37℃濕盒孵育10 min；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D）,，37℃濕盒中孵育30 min,；
10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；
11.封閉： 滴加試劑Tween 20,，37℃濕盒孵育封閉20 min,；
12.加HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM）,，37℃濕盒中孵育30 min,；
13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min），TBS洗滌（2×5 min）,；
14.顯色：應(yīng)用DAB溶液（試劑F）顯色,；
15.復(fù)染：自來水充分沖洗，復(fù)染,，脫水,，透明；
16.封片： 待組織標(biāo)本干后,，用試劑緩沖甘油封固劑封片,；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。
注意事項(xiàng)：
1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻,，自來水沖洗后方能把切片取出,，驟冷有可能導(dǎo)致結(jié)晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用,。
3. 若試劑為微量濃縮液,，用前應(yīng)低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部,。
4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌,，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會影響結(jié)果觀察,。
5. 如須復(fù)染細(xì)胞核,，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封片。
附1：
抗原修復(fù)方法
常用抗原修復(fù)液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）,、EDTA抗原修復(fù)液（pH8.0或9.0）等等,。
一、酶消化修復(fù)法
切片脫蠟水化處理,，TBS沖洗,，在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37℃孵育20~30min后TBS沖洗即可,。
二,、微波抗原修復(fù)法
微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上,，放入已沸騰的緩沖液中,，中檔或高檔繼續(xù)微波10~15min，取出微波盒冷卻至室溫后,，自來水沖洗,，取出切片。因不同微波爐微波處理時(shí)間存在差異,，須自行調(diào)整,。
三、直接高壓抗原修復(fù)法
取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰,，將組織切片置于耐高溫切片架上,，修復(fù)液沸騰后放入切片架，蓋上鍋蓋,，待噴氣后計(jì)時(shí)1.5~2.5min即可脫離熱源,，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片,。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù),。
四、隔水式高壓抗原修復(fù)法
不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰,，微波盒中加入修復(fù)液于微波爐中加熱至沸騰,，將切片放入微波盒中，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋，待噴氣后計(jì)時(shí)4~8 min即可關(guān)閉熱源,，自然冷卻至室溫后自來水沖洗,，取出切片,。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù),。
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