高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒

HighPure Rapid Mini Plasmid Kit

保存條件：本試劑盒在室溫儲(chǔ)存 18 個(gè)月不影響使用效果,。

產(chǎn)品介紹：

本試劑盒采用改進(jìn) SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞,，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低

pH 值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒 DNA,，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除,，最后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫,。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口特制吸附膜,，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好,?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

2. 獨(dú)有的去蛋白液配方,，可以高效去除殘留的核酸酶,，即使是核酸酶含量豐富的菌株如 JM 系列、HB101 也可以輕松去除,。有效防止了質(zhì)粒被核酸酶降解,。

• 快速、方便,，不需要使用有毒的苯酚,、氯防仿等試劑，也不需要乙醇沉淀,。獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高,、純度好， 可以直接用于酶切,、轉(zhuǎn)化,、PCR、體外轉(zhuǎn)錄,、測(cè)序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),。

注意事項(xiàng)：

• *次使用時(shí)，將試劑盒所帶的全部 RNase A 加入溶液 P1 后（終濃度 100ug/ml） 置于 2-8℃保存,。如果溶液 P1 中 RNase A 失活,，提取的質(zhì)粒可能會(huì)有微量 RNA 殘留,，在溶液 P1 中補(bǔ)加 RNase A 即可,。
• 環(huán)境溫度低時(shí)溶液 P2 中 SDS 可能會(huì)析出渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾 min,， 即可恢復(fù)澄清,，不要?jiǎng)×覔u晃,，以免形成過(guò)量的泡沫。

3. 避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā),、氧化,、pH 值變化。

• 溶液 P3 和去蛋白液 PE 中含有刺激性化合物,，操作時(shí)要戴乳膠手套,，避免沾染皮膚、眼睛和衣服,。若沾染皮膚,、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗,。
• 提取質(zhì)粒的量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度,、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān),。一般高拷貝質(zhì)粒,，建議接種單菌落于 1.5-4.5ml 加合適抗生素的 LB 培養(yǎng)基,， 過(guò)夜培養(yǎng) 14-16 個(gè)小時(shí),，可提取出多達(dá) 20µg 的純凈質(zhì)粒。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?10kb 的大質(zhì)粒,，應(yīng)適當(dāng)加大菌體使用量，使用 5-10ml 過(guò)夜培養(yǎng)物,，同時(shí)按比例增加 P1,、P2、P3 的用量,，其它步驟相同,。
• 得到的質(zhì)粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。OD₂₆₀ 值為 1 相當(dāng)于大約 50μg/ml DNA,。電泳可能為單一條帶,，也可能為 2 條或者多條 DNA 條帶，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動(dòng)位置不一造成,，與提取物培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短,、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過(guò) 90%,。
• 洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA,，不影響下游酶切、連接等反應(yīng),。也可以使用水洗脫,， 但應(yīng)該確保 pH 大于 7.5,，pH 過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應(yīng)該保存在－20℃,。質(zhì)粒DNA 如果需要長(zhǎng)期保存,，可以用 TE 緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA,， pH 8.0）,，但是 EDTA 可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋,。

自備試劑：無(wú)水乙醇操作步驟：

提示：

 *次使用前請(qǐng)先在漂洗液 WB 和去蛋白液 PE 瓶中加入量無(wú)水乙醇,，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇,，以免多次加入!

 將 RNase A 全部加入溶液 P1 中,，混勻，每次使用后置于 2-8℃保存,。

將溶液 P3 放在冰上預(yù)冷,，可以提高產(chǎn)量。

1. 向吸附柱AC 中（吸附柱放入收集管中）加 500μl 的平衡液BL,，12,000rpm  離心 1 min,，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中,。

2. 取 1.5-4.5ml 過(guò)夜培養(yǎng)的菌液,，12,000rpm 離心 30 sec，盡可能的倒干上清,，收集菌體,。收集超過(guò)1.5 ml 菌液， 可以離心棄上清后,，在同一個(gè) 1.5ml 管內(nèi)加入更多的菌液,，重復(fù)步驟 1，直到收集到足夠的菌體,。

3. 用 250μl 溶液 P1 重懸菌體沉淀,，渦旋振蕩至*懸浮。

4. 加 250μl 的溶液 P2,，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次使菌體充分裂解,。

5. 加 350μl 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次,，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀,，

13,000rpm 離心 10 min，小心取上清,。加入溶液 P3 后應(yīng)該立即混勻,，以免產(chǎn)生 SDS的局部沉淀,。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清

6. 將上一步所得上清加入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中）,，12,000rpm 離心 30-60sec,，倒掉收集管中的廢液可選步驟:加入 500μl 去蛋白液 PE，12,000rpm 離心 30-60sec,，棄廢液,。此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質(zhì)，如所用菌株為 JM 系列,、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株,，核酸酶含量豐富，應(yīng)加此步驟,；如所用菌株為 XL-1 Blue 和 DH5α等缺陷型菌株,，核酸酶含量低，則可略過(guò)此步驟,。

7. 加入 500μl 漂洗液 WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!）,，12,000rpm  離心 30 sec，棄掉廢液,。

8. 重復(fù)步驟 7,。

9. 將吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 離心 2 min,，盡量除去漂洗液,， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng),。                                             

10.取出吸附柱 AC,，放入一個(gè)干凈的離心管中，室溫放置幾分鐘,。

11.在吸附膜的中間部位加 50μl-100μl 洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好）,，室溫放置 2 min，12,000rpm  離心 1 min,。如果需要較多量質(zhì)粒,，

可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心 1 min,。洗脫體積越大,，洗脫效率越高。如果需要質(zhì)粒濃度較高,，可以適當(dāng)減少洗脫體積,， 但是最小體積不應(yīng)少于 50μl， 體積過(guò)小降低質(zhì)粒洗脫效率,，減少質(zhì)粒產(chǎn)量,。若用ddH₂O 做洗脫液,，應(yīng)保證其 pH 值在 7.0-8.5 范圍內(nèi)，pH 值低于 7.0 會(huì)降低洗脫效率,。