探針合成實(shí)驗(yàn)服務(wù)
探針是- -小段單鏈DNA或者RNA的片段(大約是20到500 bp),， 用于檢測(cè)與其互補(bǔ)的核酸序列,。雙鏈DNA加熱變性成為單鏈，隨后用放射性同位素(通常用磷-32),、螢光染料或者酶 (如辣根過氧化物酶)標(biāo)記成為探針,。
實(shí)驗(yàn)材料 | 基因
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試劑、試 劑盒
| 轉(zhuǎn)錄緩沖液DTT RNA酶抑制劑CTP ATP S-UTP乙酸銨乙醇
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儀器,、耗 材
| 水溶鍋,、離心機(jī)、培養(yǎng)箱,、烘箱
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實(shí)驗(yàn)步驟 | 1.在一個(gè)含SP6. T3或T7啟動(dòng)子的載體中,，插入目的基因。在編碼序列下游酶切使質(zhì)粒呈線 性,。DNAL以酚/氨0仿抽提,， 乙醇沉淀，70%乙醇洗后晾干,。以無菌水重溶沉淀至1 ug/ul,。 2.室溫配置如下反應(yīng)混合液(總體積20μl) : (1) 4.0 ul 5x轉(zhuǎn)錄緩)沖液 (2) 0.2 ul 1 mol/ DTT (3) 60 U RNA酶抑制劑 (4) 1.0 ul三種10 mmol/l NTP中的每-種 (5) 1.0 ul 1 ug/ul酶切DNA (6) 10.0μ ζ[35s] UTP (7) 16 U SP6或T7 RNA聚合酶 (8) 37*C溫育30 min,再加16 U聚合酶并于37 °C溫育40 min。 3.在反應(yīng)混合液中加入: 60 U RNA酶抑制劑,，20 μl 10 mg/ml的載體RNA和1.0μl酶1,于37°C溫育10 min以除去摸板,。 4.往反應(yīng)混合液加入以下液體: 0.8 ul 1 mol/l DTT. 63 μul 無菌水和10 μI3 mol/l乙酸鈉，取出1 ul測(cè)定其cpm/ul值,。 5.加36.4μ7.5 molM的乙酸銨于反應(yīng)混合液(終濃度2 mol/)加50~100 ug tRNA載體和272ul冷無水乙醇,，置干冰上沉淀10 min,以冷70%乙醇洗沉淀，晾干,，需要的話可重復(fù)此步,。以100μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉淀。
6.確定其cpm/μl值,， 并計(jì)算摻入百分比,，核糖核酸探針應(yīng)于2~3天內(nèi)使用。 (70%到90%的標(biāo)記摻入,，結(jié)果可得70~90 ng標(biāo)記的RNA)
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收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
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