組織細胞內(nèi)抗原的固定

組織細胞內(nèi)抗原的固定是免疫酶標和非標記免疫酶組織化學方法中的重要環(huán)節(jié)。經(jīng)過固定,，可以達到如下目的：1.標本在玻片上的吸著力增加,；2.標本所含的類脂和蠟質(zhì)等成分可以除去,，從而有利于抗原與酶標記抗體的結(jié)合,；3.標本的保存時間可以增長,，組織切片固定后,，在－20℃,，可以存放一年以上而不改變免疫酶技術(shù)的染色,；組織內(nèi)有關(guān)抗原不同，則所用固定劑與固定方法也隨之改變,。

   丙酮和乙醇是常用的兩種固定劑,。但對于許多病毒與細菌的定位研究，選擇丙酮和四氯化化碳作為固定劑是zui合適的,；對于可溶性蛋白抗原的定位,，常用乙醇；對于多糖,，則用8%－10%福爾馬林,，而不用乙醇與丙酮等有機溶劑。

   對于那些在表面覆蓋蛋白衣膜的抗原,，還常用胰蛋白酶,、黏蛋白酶、透明質(zhì)酸酶以及受體破壞酶進行處理,。有人報道,，苦味酸－甲醛固定液應用于肝組織內(nèi)甲種胎兒蛋白酶標定位能獲得滿意結(jié)果。

   對于植物病毒材料的固定,，丙酮用得zui多,，乙醇次之。因為丙酮對病毒的抗原性損害為zui小,，但對于那些不穩(wěn)定的病毒,，則應避免固定,。

   在應用免疫酶技術(shù)時,，固定處理對酶的活性的影響也得心中有數(shù)。許多固定劑對抗原的活性都 會有所損害,，例如,，福爾馬林對蛋白抗原的固定造成抗原性的破壞非常明顯。因此,，對福爾馬林的使用必須嚴格控制濃度,，一般使用的福爾馬林濃度為10%，盡管如此,，對抗原的抗原性還是有損害,，所以必須進行抗原修復,。

   另外，對于堿性磷酸酶,，在4℃下,，丙酮固定一晝夜，能喪失30%的活性,，如用丙酮固定后包埋,，則喪失70%的活性；在4℃下,，福爾馬林固定2－4h,，則喪失25%的活性。

   固定條件對標本的固定效果作用較大,。

   固定劑濃度：丙酮zui常用的是100%,；乙醇zui常用95%，但是70%乙醇的固定力為zui強,；福爾馬林常用10%,。

   固定的溫度：一般而言，固定作用隨溫度升高而加強,，室溫是zui常用的,。固定溫度可以－70－30℃。應根據(jù)不同的抗原使用不同的溫度,，麻疹病毒應在－20－40℃用丙酮固定30min,，而酶可以37℃用乙醇固定15min.

   固定液的pH：一般以所用固定劑的pH為準，但若以酶去除某些抗原表面的蛋白衣膜時,，應根據(jù)所用酶的性質(zhì)調(diào)節(jié)pH,。

   固定時的干濕度：干濕度一般情況下不需考慮，但某些材料在固定時受干濕度影響很大,。丙酮對Hela 細胞中的灰質(zhì)炎病毒固定,，在室溫干燥的情況下，N抗原就轉(zhuǎn)變?yōu)镠抗原,；而在－20℃不干燥的情況下,，N抗原保持不變。

   固定的時間：有長有短,，一般在室溫下,，固定15min左右，低溫下固定30min.如僅為了使材料不脫落為了減輕未處理的新鮮冰凍切片出現(xiàn)的空泡,，則可用丙酮,、乙醇和甲醛作短時間處理。

   固定后的沖洗：固定后的材料常用中性磷酸緩沖液反復沖洗,，以免在固定過程中可能彌散出來的物質(zhì)覆蓋表面,。

   固定標本的保存：標本材料經(jīng)固定后,，要立即使用于免疫酶技術(shù)中，不要久貯,。如實在要保存,，應置于冰箱（4℃）中，在干燥的情況下24h內(nèi)抗原性損失不大,。在－20℃下,，冰凍切片或涂片可保存1周到1個月，石蠟切片可保存數(shù)月以上,。在－20℃下保存時,，為了防止形成過多的冰結(jié)晶并發(fā)生組織細胞的變化，應將切片浸入聚乙烯醇甘油溶液中,，讓其在－20℃下形成固態(tài)保護膜,，然后在免疫酶染色前用手指加溫，用生理鹽水輕輕洗去,，每次5min,共洗3次,。這樣保存的標本，污染增多,。某些干燥標本（例如組織內(nèi)阿米巴抗原,、組織自身抗原）貯于辛烷中可長期保存（－30℃），并且?guī)缀鯚o污染,。

   固定的程序很簡單,，將固定劑用吸管加到標本上去，或?qū)吮局糜诓Ｆ苌辖牍潭▌┤芤褐?，固定后立即用磷酸緩沖液沖洗,，然后在空氣中晾干或風扇吹干。