蛋白質(zhì)提取與純化技術(shù)

選擇材料及預(yù)處理

以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ),，從分子水平上認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向,，研究蛋白質(zhì),，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理,、化學(xué)和生物等各方面知識(shí),，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別,，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中,，如鹽析，有機(jī)溶劑提取,，層析和結(jié)晶等,；二是將混合物置于單一物相中，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于來(lái)同區(qū)域而達(dá)到分離目的,，如電泳,，超速離心,，超濾等,。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸,、鹼,、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失,。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個(gè)階段：選擇材料和預(yù)處理,，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離，提取和純化,，濃細(xì),、干燥和保存。

　　微生物,、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料,，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定,。對(duì)于微生物，應(yīng)注意它的生長(zhǎng)期,，在微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量,，以微生物為材料時(shí)有兩種情況：

（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等,；

（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì),、核酸和胞內(nèi)酶等,。植物材料必須經(jīng)過(guò)去殼，脫脂并注意植物品種和生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同,，其中所含生物大分子的量變化很大,，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對(duì)動(dòng)物組織,，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料,，先進(jìn)行絞碎、脫脂等處理,。另外,，對(duì)預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，應(yīng)冷凍保存,，對(duì)于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。

蛋白質(zhì)的分離純化

一,，蛋白質(zhì)（包括酶）的提取

　　大部分蛋白質(zhì)都可溶于水,、稀鹽、稀酸或堿溶液,，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇,、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中,，因些,，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

（一）水溶液提取法

　　稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好,、溶解度大,、是提取蛋白質(zhì)zui常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍,，提取時(shí)需要均勻的攪拌,，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面,，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大,，因此，溫度高利于溶解,，縮短提取時(shí)間,。但另一方面，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活,，因此,，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過(guò)程中的降解,，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸,，碘乙酸等）。

下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇,。

1,、pH值
　　蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì),，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH 范圍內(nèi),。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化,，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化,，一般來(lái)說(shuō)，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取,，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液,。

2、鹽濃度
　　稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶,，稱為鹽溶作用,。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn),，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,，一般以0.15摩爾。升濃度為宜,。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液,。

（二）有機(jī)溶劑提取法

　　一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水,、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中,，可用乙醇,、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性,、是理想的提脂蛋白的提取液,。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別*,，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng),，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性,，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%,，40度為6.6%）不會(huì)引起酶的變性失活。另外,，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。

二,、蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化方法很多,，主要有：

（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析

　　中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響,，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶,；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí),，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析,，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中,，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,，使之“失水”,，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好,。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小,、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀,。

　　影響鹽析的因素有：

（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行,。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低,。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白,、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低,，更容易鹽析,。

（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度zui低。

（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí),，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)（共沉現(xiàn)象）,。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%,。

　　蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽,，主要有硫酸銨、硫酸鎂,、硫酸鈉,、氯化鈉、磷酸鈉等,。 其中應(yīng)用zui多的硫酸銨,，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升,；0度時(shí)飽和溶解度為3.9M,，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi),，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái),；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性,。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié),。

　　蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后,，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析,，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙）,，用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液,，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng),，所以在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過(guò)柱的辦法除鹽,，所用的時(shí)間就比較短,。

2、等電點(diǎn)沉淀法

　　蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力zui小,，因而溶解度也zui小,，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀,，但此法很少單獨(dú)使用,，可與鹽析法結(jié)合用,。

3,、低溫有機(jī)溶劑沉淀法

　　用與水可混溶的有機(jī)溶劑,，甲醇，乙醇或丙酮,，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性,，應(yīng)在低溫下進(jìn)行,。

（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾

　　透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開,。

　　超濾法是利用高壓力或離心力,，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上,，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì),。

2、凝膠過(guò)濾法

　　也稱分子排阻層析或分子篩層析,，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物zui有效的方法之一,。柱中zui常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。

（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同,，可將其分開,。

1、電泳法

　　各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下,，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開,。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度,，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止,，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì),。

2、離子交換層析法

　　離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑（如：羧甲基纖維素,；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素,；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí),，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。（詳見(jiàn)層析技術(shù)章）

（四）根據(jù)配體特異性的分離方法－親和色譜法

　　親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,，它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái),，而且純度很高,。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體（Ligand）的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在,，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分,，至今還沒(méi)的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái),，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

細(xì)胞的破碎

1,、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液,，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋,，將調(diào)速器先撥至zui慢處,，開動(dòng)開關(guān)后，逐步加速至所需速度,。此法適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織,、植物肉質(zhì)種子等。

2,、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中,，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng),，即可將細(xì)胞研碎,，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織,。

3,、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂,，此法多適用于微生物材料,，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘,，此法的缺點(diǎn)是在處理過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施,。對(duì)超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用,。

4、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍,，室溫融解,，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹,，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎,。

5,、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）,、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞,，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好,。

　　無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞,，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中,，使大分子生物降解,，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用,；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部,，還可通過(guò)選擇pH,、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取,。

濃縮,、干燥及保存
一、樣品的濃縮
　　生物大分子在制備過(guò)程中由于過(guò)柱純化而樣品變得很稀,，為了保存和鑒定的目的,，往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的：

1,、減壓加溫蒸發(fā)濃縮
　　通過(guò)降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低,，減壓的真空度愈高，液體沸點(diǎn)降得愈低,，蒸發(fā)愈快,，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。

2,、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮 空氣的流動(dòng)可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液,，表面不斷通過(guò)空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室,，用電扇對(duì)準(zhǔn)吹風(fēng),，使透過(guò)膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮目的,，此法濃縮速度慢,，不適于大量溶液的濃縮。

3,、冰凍法 生物大分子在低溫結(jié)成冰,，鹽類及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中,，操作時(shí)先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解,，利用溶劑與溶質(zhì)融點(diǎn)介點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的,。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時(shí)，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面,，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中,，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液,。

4,、吸收法 通過(guò)吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng),，對(duì)生物大分子不吸附,，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇,，聚乙稀吡咯酮,、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時(shí),，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里,，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去,，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的體積,。

5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過(guò)濾的方法,，不液體在一定壓力下（氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡海┩ㄟ^(guò)膜時(shí),，溶劑和小分子透過(guò)，大分子受阻保留,，這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新方法,，zui適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低,，操作方便,，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性,，回收率高等優(yōu)點(diǎn),。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇，不同類型和規(guī)格的膜,，水的流速,，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子zui小分子量值）等參數(shù)均不同，必須根據(jù)工作需要來(lái)選用。另外,，超濾裝置形式,，溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對(duì)超濾效果的一定影響,。Diaflo 超濾膜的分子量截留值：

膜名稱 分子量截留值 孔的大的平均直徑
XM－300 300,，000               140
XM－200 100，000                55
XM－50 50,，000                30
PM－30  30,，000                22
UM－20 20，000                18
PM－10 10,，000                15
UM－2 1,，000                12
UM05 500                 10

　　用上面的超濾膜制成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束,，管的兩端與低離子強(qiáng)度的緩沖液相連,，使緩沖液不斷地在管中流動(dòng)。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中,。當(dāng)緩沖液流過(guò)纖維管時(shí)，則小分子很易透過(guò)膜而擴(kuò)散,，大分子則不能,。這就是纖維過(guò)濾秀析法，由于透析面積增大,，因而使透析時(shí)間縮短10倍,。

二、干燥
　　生物大分子制備得到產(chǎn)品,，為防止變質(zhì),，易于保存，常需要干燥處理,，zui常用的方法是冷凍干燥和真空干燥,。真空干燥適用于不耐高溫，易于氧化物質(zhì)的干燥和保存,，整個(gè)裝置包括干燥器,、冷凝器及真空干燥原理外，同時(shí)增加了溫度因素,。在相同壓力下,，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下,，冰很易升華為氣體,。操作時(shí)一般先將待干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松,、溶解度好,、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，適用于各類生物大分子的干燥保存,。

三,、貯存
　　生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定,，在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無(wú)明顯變化,，貯藏要求簡(jiǎn)單，只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封,，保持0－4度冰箱即可,，液態(tài)貯藏時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。

1,、樣品不能太稀,，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性,。

2,、一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑，常用的防腐劑有甲苯,、苯甲酸,、氯仿、百里酚等,。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊,、蔗糖、甘油等,，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性,。此外，鈣,、鋅,、硼酸等溶液對(duì)某些酶也有一定保護(hù)作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中,。

3,、貯藏溫度要求低，大多數(shù)在0度左右冰箱保存,，有的則要求更低,，應(yīng)視不同物質(zhì)而定。

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