雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法,，操作步驟如下：  
1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),。  
2） 加受檢標(biāo)本,，保溫反應(yīng),。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì),。  
3） 加酶標(biāo)抗體,，保溫反應(yīng),。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān),。  
4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量,。在臨床檢驗(yàn)中,，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,，例如HBsAg,、HBeAg,、AFP,、hCG等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體,，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法,。如抗體的來(lái)源為抗血清,，包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體,，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物,。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng),，作一步檢測(cè),。  
在一步法測(cè)定中,，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復(fù)合物",。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象,，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過(guò)剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過(guò)剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見1.3.2，圖1-4）,，如按常法測(cè)讀,，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect）,，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落,。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg,、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的zui高值,。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng),。  
假使在被測(cè)分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇,，也可用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物,。但在HBsAg的檢測(cè)中應(yīng)注意亞型問(wèn)題，HBsAg有adr,、adw,、ayr、ayw4個(gè)亞型,，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問(wèn)題。  
雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾,。RF是一種自身抗體,，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合,。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF,，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng),。采用F（ab'）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段,，從而消除RF的干擾,。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)（參見6.2）。  
雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原,，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原,，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。  

2. 雙抗原夾心法測(cè)抗體  
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似,。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體,。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法,。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,，尋找合適的標(biāo)記方法。