AxyPrep 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量試劑盒

本試劑盒采用 SDS 堿裂解法,，結(jié)合DNA制備膜選擇性吸附DNA,。同時采用特殊溶液（Buffer ETR和 Buffer PF）有效去除內(nèi)毒素，可從 80-200 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物中提取出多至 500 礸高純度質(zhì)粒DNA,，其內(nèi)毒素水平控制在0.1 EU/礸以下,。

一、 試劑盒組成,、貯存,、穩(wěn)定性

RNase A：50 mg/ml，室溫可貯存 6 個月,，長期貯存于-20℃,。

Buffer S1：細(xì)菌懸浮液。加入 RNase A 后,，混合均勻,，4℃貯存。

Buffer S2：細(xì)菌裂解液（含 SDS/NaOH）,，室溫密閉貯存,。

Buffer S3K：中和液，室溫密閉貯存,。

Buffer B：DNA 結(jié)合溶液,，室溫密閉貯存。

Buffer W1：洗滌液,，室溫密閉貯存,。

Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前,，按試劑瓶上的體積加入無水乙醇（可用無水乙醇或 95%乙醇）,。混合均勻,，室溫密閉貯存,。

ET-free water (70% Ethanol)：使用前，按試劑瓶上的體積加入無水乙醇（可用無水乙醇或 95%乙醇）,?；旌暇鶆颍覝孛荛]貯存,。

Eluent A：洗脫液,。室溫密閉貯存。

Buffer ETR：內(nèi)毒素去除液,。室溫密閉貯存,。

Buffer PF：分相緩沖液,。室溫密閉貯存。

二,、 注意事項

細(xì)菌過量將影響細(xì)菌裂解、質(zhì)粒 DNA 的釋放,，導(dǎo)致內(nèi)毒素含量過高,。

步驟 3 和步驟 4 的操作必須溫和。劇烈搖晃將導(dǎo)致基因組 DNA 的污染,。但混合必須充分,，否則影響得率。

在加入 Buffer S3K 時,，蛋白質(zhì)和基因組 DNA 形成粘稠的白色絮狀沉淀,，必須充分混合均勻，使凝集塊中間也得到充分中和凝結(jié),。

Buffer S2,、Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer W1 含刺激性化合物,，操作時要戴乳膠手套和防護(hù)眼鏡,，避免沾染皮膚、眼睛和衣物,，謹(jǐn)防吸入口鼻,。若沾染皮膚、眼睛時,，要立即用大量清水或生理鹽水沖洗,，必要時尋求醫(yī)療咨詢。

三,、 實驗準(zhǔn)備

次使用前,，RNase A 全部加入 Buffer S1 中，4℃貯存,。

次使用前,，Buffer W2 concentrate 中加入體積的無水乙醇。

次使用前,，ET-free water (70% Ethanol)中加入體積的無水乙醇,。使用前置于-20℃預(yù)冷。

使用前,，檢查 Buffer S2 是否出現(xiàn)沉淀,，如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)于 37℃溫浴加熱溶解并冷卻至室溫后使用,。

Eluent A 在 65℃預(yù)熱后使用,，有利于提高質(zhì)粒得率,。

Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer ETR 使用前置于 4℃預(yù)冷,。

準(zhǔn)備無核酸和核酸酶污染的 Tip 頭,、50ml 離心管。

水平離心機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)到 4,000×g）及冷凍離心機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)到 8,000×g）

準(zhǔn)備 56℃水浴,。

四,、 操作步驟

• 取 80-200 ml 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液（若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應(yīng)減半或更少）,，3,000 ×g 離心 8 min,，棄上清。將離心管倒置于紙巾上 1 min,，除盡上清,。
  • 一般過夜培養(yǎng)的菌液 OD600 在 2.0-4.0 之間。若菌液 OD600 >4,，菌量需減少,。

加 10 ml Buffer S1，懸浮細(xì)菌沉淀,，懸浮需均勻,，不應(yīng)留有小的菌塊。

確認(rèn) Buffer S1 中已加入 RNase A,。

• 加 10 ml Buffer S2,，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液,。此步驟不宜超過 5 min,。
  • Buffer S2 使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH,，降低溶菌效率,。

避免劇烈搖晃，否則將導(dǎo)致基因組 DNA 污染,。

此步驟不宜超過 5 min,。

• 加 10 ml 4℃預(yù)冷的 Buffer S3K，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合,，直至溶液顏色均一并形成緊實的凝集塊,，室溫放置 5 min。
• 加入 Buffer S3K 后應(yīng)立即混合,，以避免形成局部的凝結(jié)塊,。

避免劇烈搖晃，否則將導(dǎo)致基因組 DNA 污染,。

5.加 10 ml 4℃預(yù)冷的 Buffer B,，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合 10 次,，8,000×g 離心（4℃）10 min。

步驟 6-9 可以選擇離心法或負(fù)壓法,。

• 離心法：

6A. 先將大量制備管放入 50 ml 離心管中,。吸取步驟 5 中的混合液，轉(zhuǎn)移到大量濾器（Maxiprepsyringe filter）中,。

7A. 插入推桿,，垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中，≥6,000×g 離心 5 min,。 8A. 棄濾液，加 12 ml Buffer W1 至制備管中,，≥6,000×g 離心 5 min,。

9A. 棄濾液，加 14 ml Buffer W2 至制備管中,，≥6,000×g 離心 5 min,。

• 確認(rèn)在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。

• 負(fù)壓法：

6B. 正確連接負(fù)壓裝置,，將大量制備管插到負(fù)壓裝置的插口上,。

7B. 吸取步驟 5 中的上清液，轉(zhuǎn)移到大量濾器中,，插入推桿,，垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中，開啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓至-25 ~ -30 英寸汞柱,，緩慢吸走管中溶液,。

8B. 保持負(fù)壓，加 12 ml Buffer W1,，吸盡管中溶液,。

9B. 保持負(fù)壓，加 14 ml Buffer W2,，吸盡管中溶液,。

確認(rèn)在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。

再在大量制備管中加 4 ml Buffer W2,，≥6,000×g 離心 5 min,。

將制備管置于另一潔凈 50 ml 離心管中，在制備管膜中央加 2 ml Eluent A,，室溫靜置 5 min,，≥6,000×g 離心 5 min 收集質(zhì)粒 DNA。

將 Eluent A 加熱至 65℃將提高洗脫效率,。

棄制備管,。在濾液中加入 4 ml 預(yù)冷的 Buffer ETR,，混合均勻。

如果 Buffer ETR 渾濁,，于冰上靜置,，直至溶液變得清亮；如果分層,，則混合均勻,。

加入 1 ml Buffer PF，混合均勻,。

*溶液可能會出現(xiàn)微弱的渾濁現(xiàn)象,，此為正常現(xiàn)象,。

置于 56°C 孵育 8 min,。室溫 4,000×g 離心 5 min。

孵育后溶液將出現(xiàn)大量乳白色沉淀,，否則延長孵育時間,。

孵育后溶液有可能出現(xiàn)分層現(xiàn)象，此為正?，F(xiàn)象,。

此步驟的離心必須使用吊籃式（swing-out rotor）離心機(jī)或其他水平離心機(jī)

取無色上相至 50 ml 離心管中，加入 0.8 倍體積異丙醇（如：取得 6 ml 無色上相,，則加入 4.8 ml 異丙醇）,，混合均勻。室溫靜置 10 min,。8,000×g 離心 10 min,。

盡可能棄盡上清。加入 2 ml 預(yù)冷的 ET-free water（70% Ethanol）,，洗滌沉淀,，8,000×g 離心 5 min。

ET-free water（70% Ethanol）使用前確定已加入體積的無水乙醇,。

盡可能棄盡上清,。在超凈臺中干燥 10-15 min。

管壁上殘留液體可短暫離心后吸棄,。

加入 500 祃 Eluent A 或無內(nèi)毒素水溶解質(zhì)粒 DNA,。

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