EF33B\J2                      2016-01版

β-興奮類

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的β-興奮類藥物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗β-興奮類藥抗體，加入酶標(biāo)記物后,，用TMB底物顯色,，樣本吸光值與其所含β-興奮類藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)β-興奮類藥物的含量,。

二,、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.1ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時間：       30min～15min
• 樣本檢測下限

豬   尿 ··········································  0.3ppb

豬   肉 ··········································  0.6ppb

• 交叉反應(yīng)率

克倫特羅（Clenbuterol）·························  100%

西馬特羅（Cimaterol）   ·······················  <4%  

溴布特羅（Brombuterol）   ······················  60%

馬布特羅（Mabuterol）  ·························  108%

班布特羅（Bambuterol）  ······················   <5%

氯丙那林（Clorprenaline）  ·····················  <1%

沙丁胺醇（Salbutamol）  ·························  75%

特布他林（Terbutaline ）  ······················  25%

噴布特羅（Penbutolol）  ·························  19%

妥布特羅（Tulobuterol）  ························  23%

菲諾特羅（Fenoterol）  ····························<0.1%

萊克多巴胺（Ractopamine） ······················ <0.1%

• 樣本回收率

豬 尿、豬 肉  ····························  90%±30%

三,、試劑盒組成

四、所用儀器,、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀,、離心機、恒溫箱,、打印機

微量移液器：單道 20～200µl,、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：氫氧化鈉,、濃鹽酸

五,、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭,。

   （b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果,。

• 樣本前處理需配制：

配液1   0.2M 鹽酸

取 17.2ml 濃鹽酸加去離子水定容至 1L,。

配液2   1M 氫氧化鈉

    稱取4g 氫氧化鈉固體加去離子水定溶至    

    100ml。

配液3   樣本提取液

    5X樣本提取液用去離子水1：4稀釋,。

• 樣本處理：

（a）豬肉樣本的處理方法

• 稱取 2 ± 0.05g 均質(zhì)后的組織于50ml離心管中,，加入3ml 0.2M鹽酸（見配液1），充分振蕩3min,。
• 再加入600ul 1M 氫氧化鈉（見配液2）溶液和2.4ml 樣本提取液（見配液3）溶液,，充分振蕩3min，室溫4000r/min 以上離心10min。
• 取20 µl上層液體用于分析,。（注：離心后若有脂肪層,，去除脂肪層或撥開脂肪層，取清澈液體進行分析）,。

樣本稀釋倍數(shù)：  4倍

（b）豬尿樣本的處理方法

取20µl清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定

要過濾或4000r/min離心10min,，直至得到清亮

尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存,。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍

六,、 酶標(biāo)免疫分析程序:

• 測定前應(yīng)須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
• 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃,。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點,。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板,。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上,，注意每種液體試劑使用前均須搖勻,。
• 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋,，保存于2～8℃,。
• 配液：將 40ml濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液,。
• 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。
• 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20µl/孔到各自的微孔中,，加入酶標(biāo)記物50µl/孔，然后加入80µl/孔的抗體工作液,，用蓋板膜蓋板,，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應(yīng)30min,。
• 將孔內(nèi)液體甩干,，用洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒,，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯色15min,。
• 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻,，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值,。

七,、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法,。注意樣本吸光度值與其所含β-興奮量成負(fù)相關(guān)。

1,、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0,，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243,； 0.1ppb為1.816；0.3ppb為1.415,；0.9ppb為0.74,；2.7ppb為0.313；8.1ppb為0.155,。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb,；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中β-興奮類藥物實際濃度,。

2,、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值,，再乘以100%,，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以β-興奮標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中β-興奮類藥物實際濃度,。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析,。

八,、 注意事項

• 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作,。
• 混合要均勻,，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚,。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD值變化,；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封,；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之,。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì),。
• 該試劑盒理想反應(yīng)溫度為25℃,，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

九,、儲藏條件和保質(zhì)期

• 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍,。
• 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,，酶標(biāo)板仍然正常有效,，不影響實驗結(jié)果，請放心使用,。

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