EF03B-J2b                     2016-01版

喹諾酮類

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

    試劑盒采用間接競爭ELISA方法,，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的殘留物喹諾酮類藥物和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗喹諾酮類藥物抗體,，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色,，樣本吸光值與其所含殘留喹諾酮類藥物的含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物喹諾酮類藥物的含量。

二,、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：      0.1ppb
• 孵育溫度：          25℃
• 孵育時(shí)間：          30min～15min
• 樣本檢測下限

組織 ,、血清 ········································  1ppb

• 交叉反應(yīng)率

恩諾沙星（ENR）   ··························    100%

環(huán)丙沙星（CIF）   ····························    100%

氧氟沙星（OFL）    ··························    60%

奧索利酸（OXO）  ···························  116.86%

達(dá)氟沙星（DAN）  ···························  102.63%

諾氟沙星（NOR）  ···························  148.65%

洛美沙星（LOM）  ··························   86.24%

培氟沙星（PEF）   ··························  156.60%

依諾沙星（ENO）  ···························   98.97%

氟喹酸（FLU）    ···························   96.73%

麻保沙星（MAR）  ··························  110.63%

氨氟沙星（AMI）  ···························   98.86%

那氟沙星（NAD）  ···························   56.81%

• 樣本回收率

組織、血清 ·································     85±20%

三,、試劑盒組成

四、所用儀器,、試劑

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀,、打印機(jī)、均質(zhì)器 ,、振蕩器、離心機(jī),、刻度移液管,、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道 20～200ul、單道100～1000ul,、多道 250 ul

五,、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（a） 實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭,。

（b） 實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。

• 樣本前處理需配制：

配液1  樣本復(fù)溶液 

將20X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：19（1份濃縮復(fù)溶液+19份去離子水）進(jìn)行稀釋。

• 樣本處理：

a）組織樣本處理方法

1,、稱1.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中,；

2、加入10ml樣本復(fù)溶液,，振蕩3min,，4000r/min以上，15℃離心10min,；

3,、取上清50µl液體用于分析。

     樣本稀釋倍數(shù)：10

b）血清樣本處理方法

• 取50µl澄清的血清,，加入450µl 樣本復(fù)溶液混合,，混勻30S（如果血清樣本渾濁，將樣本于10℃，4000r/min以上離心10min,，分離出血清或過濾血清,，直至得到澄清的樣本）；
• 取50µl液體用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù):  10倍  

六,、 酶標(biāo)免疫分析程序:

• 測定前應(yīng)須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
• 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃,。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn),。
• 所有恒溫孵育過程,，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板,。

• 操作步驟：

• 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出,，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 按需要取出微孔條及板架,，將不用的微孔板重新密封,，保存于2-8℃，不要冷凍,。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水）,，或按所需用量配制洗滌液。
• 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均需做2孔平行,，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔的樣本孔所在的位置。
• 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔,，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔,，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻,，用蓋板膜蓋板,，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
• 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次,，每次浸泡15-30秒,，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 顯色：每孔加入底物A液50µl再加入底物B液50µl,，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境避光顯色15min。
• 測定：每孔加入終止液50µl,，輕輕振蕩混勻,，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）,。

七,、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法,。注意樣本吸光度值與其所含喹諾酮類藥物量成負(fù)相關(guān)。

1,、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946,，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.845,； 0.1ppb為1.542；0.3ppb為1.130,； 0.9ppb為0.635,；2.7ppb為0.326； 8.1ppb為0.156,。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb - 8.1ppb,；樣本2的濃度范圍是0.3ppb - 0.9ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物的實(shí)際濃度,。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算,，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值,，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),，以喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析。

八,、 注意事項(xiàng)

• 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作,。
• 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒,；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑,。
• 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封,；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下,。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí),，表示試劑可能變質(zhì),。
• 該試劑盒反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

九,、儲藏條件和保質(zhì)期

• 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍,。
• 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,，酶標(biāo)板仍然正常有效,，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請放心使用,。

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