大鼠二?；视停―AG）elisa試劑盒說明書

試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿,，細胞上清及相關(guān)液體樣本中二?；视停―AG）的含量。實驗原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中大鼠二?；视?（DAG）水平,。用純化的大鼠二酰基甘油 （DAG）抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入二酰基甘油 （DAG）,，再與 HRP標記的二?；视?（DAG）抗體結(jié)合，形成抗體 -抗原-酶標抗體復(fù)合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB顯色,。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的二?；视?（DAG）呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度（ OD值）,，通過標準曲線計算樣品中大鼠二?；视?（DAG）濃度。
試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1.  血清：室溫血液自然凝固 10-20分鐘,，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。

2.  血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇 EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20分鐘后,，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心。

3.  尿液：用無菌管收集,，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實行。

4.  細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集,。離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。檢測細胞內(nèi)的成份時,，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到 100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心 20分
鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。
5.  組織標本：切割標本后,，稱取重量。加入一定量的 PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?2-8℃的溫度,。加入一定量的 PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用,。

6. 標本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于 -20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融 .

7.  不能檢測含 NaN3的樣品,，因 NaN3抑制辣根過氧化物酶的（ HRP）活性,。

操作步驟：

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔 10孔，在*,、第二孔中分別加標準品 100μl,，然后在*,、第二孔中加標準品稀釋液 50μl，混勻,；然后從*孔,、第二孔中各取 100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標準品稀釋液 50μl,，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl棄掉,，再各取 50μl分別加到第五,、第六孔中，再在第五,、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul,，混勻；混勻后從第五,、第六孔中各取 50μl分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl,，混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl加到第九,、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液 50μl，混勻后從第九第十孔中各取 50μl棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl,，濃度分別為 150 pmol/L, 100pmol/L , 50pmol/L, 25pmol/L, 12.5pmol/L）。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）,、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl,，然后再加待測樣品 10μl（樣品zui終稀釋度為 5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。

3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 3 0分鐘。

4. 配液：將 30（48T的 20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T的 20倍）倍稀釋后備用,。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置 30秒后棄去,，如此重復(fù) 5次,，拍干,。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外,。

7. 溫育：操作同 3,。

8. 洗滌：操作同 5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl,，再加入顯色劑 B50μl,，輕輕震蕩混勻， 37℃避光顯色15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液 50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。

11. 測定：以空白空調(diào)零， 450nm波長依序測量各孔的吸光度（ OD值）,。測定應(yīng)在加終止液后 15分鐘以內(nèi)進行,。

注意事項：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果,。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差,。一次加樣時間控制在 5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

4．請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔,。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD值大于標準品孔*孔的 OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5．封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存,。

7．嚴格按照說明書的操作進行,，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準 .

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9．本試劑不同批號組分不得混用,。

10. 如與英文說明書有異,，以英文說明書為準。

計算：
以標準物的濃度為橫坐標,， OD值為縱坐標,，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與 OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。
 
試劑盒性能：
1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R值為 0.990以上,。
2. 批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于 9%和 11%

檢測范圍：
5pmol/L -200pmol/L
保存條件及有效期：
1 2-8℃。
2 6個月

公司專業(yè)銷售各種品牌價格檔次的ELISA試劑盒,，品種齊全,*,。服務(wù)于高校及免疫學(xué)科研單位。*,，售后服務(wù)完善,。并提供免費代檢測，更好的為您服務(wù),。

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