幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）

細(xì)胞介紹

BHK-21細(xì)胞系（Baby hamster kidney cell line）是從敘利亞幼鼠腎組織中分離培養(yǎng)獲得的成纖維型貼壁細(xì)胞系，其可連續(xù)傳代,。BHK-21細(xì)胞系可以用于多種病毒的增殖和純化,，如口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）,、腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,，EMCV）、呼腸孤病毒（Reovirus）,、水皰性口炎病毒（Vesicularstomatitis virus,，VSV）等。目前,，BHK-21細(xì)胞系已被廣泛應(yīng)用于口蹄疫疫苗的生產(chǎn),。

細(xì)胞特性

1） 來源：倉鼠腎

2） 形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣，貼壁生長

3） 含量：>1x10⁶

4） 污染：支原體,、細(xì)菌,、酵母和真菌檢測為陰性

5） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

運(yùn)輸和保存：可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式：（1）干冰運(yùn)輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮或者-80度冰箱凍存或直接復(fù)蘇,；（2）存活細(xì)胞,，收到后應(yīng)繼續(xù)生長，傳代達(dá)到細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),，再進(jìn)行凍存,。具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。

收到細(xì)胞后請拍照,，3天內(nèi)如果發(fā)現(xiàn)污染,，請及時(shí)拍照與我們聯(lián)系,。

細(xì)胞用途：僅供科研使用,。

細(xì)胞接收后的處理：

1） 收到細(xì)胞后,，請檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況,，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請拍照后及時(shí)聯(lián)系我們,。

2） 在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)時(shí),，hao在低倍鏡（4或5X物鏡)下進(jìn)行,，能準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的傳代密度,。看細(xì)胞的形態(tài)請?jiān)?0X和20×物鏡下,，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照,，（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,，作為細(xì)胞需要售后時(shí)提供收到細(xì)胞時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù),。

3） 觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,。

4） 貼壁細(xì)胞：在運(yùn)輸過程中貼壁細(xì)胞會(huì)有脫落的現(xiàn)象,，如發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞有脫落或者脫落后抱團(tuán)生長，可將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞1000rpm離心5分鐘,，棄去上清重懸后接種到加有按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基的原培養(yǎng)瓶中（或新的培養(yǎng)瓶中）。

5） 懸浮細(xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細(xì)胞1000rpm離心5分鐘,，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基）。

6）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞,，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后第yi次傳代建議1：2傳代 。

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備MEM（推薦iCell-0012）培養(yǎng)基,；優(yōu)質(zhì)胎牛血清,，10%；雙抗1%,。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣,，95%；二氧化碳,，5%,。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

3） 凍存液：90%血清,，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細(xì)胞懸液加入10cm皿中,，加入約8ml培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞,，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4. 收到細(xì)胞后*傳代推薦將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用,，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2到1:5的比例進(jìn)行,。

細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。

下面T25瓶為例,；

      1．細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后,，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml*培養(yǎng)基終止消化,，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),。

      2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮,，加DMSO至終濃度為10%,。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中,，注意凍存管做好標(biāo)識(shí),。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X10⁶個(gè)細(xì)胞凍存。

3．將凍存管置于程序降溫盒中,，放入-80度冰箱,，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取,。

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后,，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,，請立即與我們聯(lián)系,。

2. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作,，并請注意防護(hù),，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。

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