琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase,，SDH）試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

SDH（EC 1.3.5.1）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中,。SDH是線粒體的一種標(biāo)志酶，位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶,，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一,。

此外，為多種原核細胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子,。

測定原理

SDH 催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸,，脫下的氫通過吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原2,6-

二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm 處具有特征吸收峰,，通過600nm吸光度的變化,，測定2．6-DPIP 的還原速度，代表SDH 酶活性,。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、水浴鍋、臺式離心機,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制

試劑一：100mL×1 瓶，-20℃保存,；

試劑二：20mL×1 瓶,，-20℃保存；

試劑三：1.5mL×1 支,，-20℃保存,；

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存,；

試劑五：粉劑×1 支,，-20℃保存；

樣本的前處理

組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1,、稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2,、將勻漿600g，4℃離心5min,。

3、棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心10min,。

4,、上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的SDH（此步可選做）,。

5,、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎, 冰浴,，功率20％或200W,，超聲3秒，間隔10秒,，重復(fù)30次）,，用于線粒體SDH活性測定。

測定步驟和加樣表

1,、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至600nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測定

（1）在試劑四中加入18mL蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴10min,；用不完的試劑4℃保存一周,；

（2）在試劑五中加入1mL蒸餾水，充分溶解待用,；用不完的試劑 4℃保存一周,；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑五和180μL試劑四,，混勻,，立即記錄600nm處20s時的吸光值 A1和1min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2,。

SDH 活性的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。

SDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T

=952×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。

SDH 活性（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10 ^-4 L,；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10 ⁴ L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V 樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500 萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。

SDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1904×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位,。

SDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

SDH 活性（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10 ^-4 L,；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L/mol/cm,；d：96 孔板光徑,，0.5cm；V 樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V 樣總：加入提取液體積，0.202mL,；T：反應(yīng)時間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500 萬。

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