考馬斯亮藍法測蛋白含量測定試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定，

確保蛋白濃度在0~1000µg/ml范圍內(nèi),。

測定意義

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計算。此外,，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析,。

測定原理

在酸性溶液中，考馬斯亮藍G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合形成藍色復(fù)合物,；該復(fù)合物在595nm處有大吸收峰,， 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該方法靈敏度高,，適合微量蛋白質(zhì)分析,。

自備儀器和用品

離心機、可見分光光度計,、移液器,、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一：液體×1 瓶,，4℃保存,。

標準品：液體×1 瓶，4℃保存,。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取

1. 液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測定,。

2. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10的比例（建議稱取約 0.1g組織，加入1mL提取液（自備,，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水）冰浴勻漿,，8000g，4℃離心10min,，取上清,，即待測液。（動物樣品常常需要稀釋）

3. 細菌,、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間 3min）,；然后 8000g，4℃,，離心 10min,，取上清置于冰上待測。

測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱30min,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL蒸餾水,，1000μL試劑一,，混勻后室溫靜置10min，

于595nm比色,，10~20min 完成比色,，記為A空白管。

3. 標準管：取1mL玻璃比色皿,，加入200μL標準液,，1000μL試劑一，混勻后室溫靜置10min,，

于595nm比色，10~20min 完成比色,，記為A標準管,。

4. 測定管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL待測液,，1000μL試劑一,，混勻后室溫靜置10min，

于595nm比色,，10~20min完成比色,，記為A測定管。

注意：空白管和標準管只需要測定一次,。

計算公式:

Cpr（µg/mL）= C標準管×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

=50×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)

C 標準管：標準品蛋白質(zhì)濃度,，50μg/mL。

注意事項：

1.加考馬斯亮藍后,，在10~20min 內(nèi)吸光值相對較穩(wěn)定,，因此須在10~20min 完成比色。

2.不宜用石英比色皿,，可用玻璃或塑料比色皿,，測完成后立即用 95%乙醇沖洗,。

3.測定前用1~2個樣做預(yù)實驗，確保蛋白濃度在0~1000µg/ml 范圍內(nèi),，否則需要做相應(yīng)稀釋,，使得稀釋后的結(jié)果在 0~1000µg/ml 范圍內(nèi)，然后再乘以稀釋倍數(shù),。

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