氯霉素快速檢測試劑盒說明書

一,、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的殘留物氯霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素抗體，加入酶標記物后,，用TMB底物顯色,，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物氯霉素的含量,。

二,、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.02ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時間：       30min～15min
• 樣本檢測限

組織、蜂蜜,、牛奶···································· 0.1ppb

奶粉,、蛋類、尿樣,、飼料··························· 0.15ppb

• 交叉反應率

氯霉素 ·············································· 100%

甲砜霉素 ········································· < 0.1%

氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%

• 樣本回收率

組織,、蛋類,、奶粉·····························  85%±20%

蜂蜜,、牛奶、飼料·····························  93%±25%

尿樣··········································  100%±25%

三,、試劑盒組成

四、所用儀器,、試劑

具備的儀器：酶標儀,、均質器、振蕩器,、離心機,、刻度移液管、天平（感量0.01g）,、氮吹儀,、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl,、多道 30～300 µl

試      劑：乙酸乙酯,、正己烷

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時要更換吸頭,。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔,，以避免污染干擾實驗結果,。

• 樣本前處理需配制：

配液1  樣本復溶液：

將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。

• 樣本處理：

（a）肌肉組織樣本處理方法

• 稱取均質后的新鮮樣本3±0.05g于50ml離心管中,，加入3ml去離子水后再加入6ml乙酸乙酯,，振蕩1min,，室溫4000r/min以上離心10min；
• 取出4ml上層液體在50-60℃氮氣流中吹干,； 
• 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物,，再加1ml樣本復溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心10min,；去除上層有機相,；
• 取50 µl下層相用于分析。

樣本稀釋倍數:  0.5倍 

此方法無法檢測肝臟類樣本,，處理時易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,，影響檢測結果(乳化時建議處理方法：去除上層有機相再加入2ml正己烷混合30s，室溫4000r/min以上離心10min,；去除上層有機相),。

（b）蜂蜜處理方法

• 稱取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中,，用2ml去離子水溶解,；加入6ml乙酸乙酯振蕩1min，室溫4000r/min以上離心10min,；
• 移取3ml上層清澈液到另一離心管中,，50-60℃氮氣流下干燥；用0.5ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物,，混合30s,；
• 取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數：  0.5倍  

（c）牛奶,、奶粉,、蛋類樣本處理方法

• 稱取均質后的新鮮樣本2±0.05g（或2ml）于50ml離心管中，加入6ml乙酸乙酯,，振蕩1min,，室溫4000r/min以上離心10min；
• 取出3ml上層液體在50-60℃氮氣流中吹干,； 
• 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物,，再加1ml樣本復溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心10min,；去除上層有機相,；
• 取50 µl下層相用于分析。

樣本稀釋倍數:  1倍 

處理時如無法取到3ml上層液體,，可以重復離心后再取液,，或加入10ml乙酸乙酯后取5ml吹干，稀釋倍數不變。

（d）尿樣,、飼料樣本處理方法

• 稱取均質后的新鮮樣本1±0.05g（或1ml）于50ml離心管中,，加入6ml乙酸乙酯，振蕩1min,，室溫4000r/min以上離心10min,；
• 取出3ml上層液體在50-60℃氮氣流中吹干； 
• 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物,，再加1ml樣本復溶液混合30s,，室溫4000r/min以上離心10min；去除上層有機相,；
• 取50 µl下層相用于分析,。

樣本稀釋倍數:  2倍 

六、 酶標免疫分析程序:

• 測定前應須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）,。
• 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃,。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性,，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點,。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板,。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,，室溫（20～25℃）平衡30min以上,，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 取出框架及需要數量的微孔,，將不用的微孔放入自封袋,，保存于2-8℃。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水）,，或按所需用量配制洗滌液,。
• 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行,，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置,。
• 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加入酶標記物50µl/孔,，后加入抗體工作液50µl/孔,，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻,。25℃環(huán)境中反應30min,。
• 將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次,，每次間隔15～30秒,，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
• 測定：加入終止液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數）,，測定每孔OD值,。

七、結果判定

結果判定有兩種方法,，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含氯霉素量成負相關,。

1,、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3,，樣本2的吸光度值為1.0,，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.143； 0.02ppb為1.816,；0.06ppb為1.415,；0.18ppb為0.74；0.54ppb為0.313,；1.62ppb為0.155,。則樣本1的濃度范圍是0.54ppb～1.62ppb；樣本2的濃度范圍是0.06ppb～0.18ppb,，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氯霉素實際濃度,。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算,，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%,，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以氯霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標,，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氯霉素實際濃度,。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,，更便于大量樣本的準確、快速分析,。（歡迎索取）

八,、 注意事項

• 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低,。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性,，重復性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
• 混合要均勻,，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
• 反應終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚,。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD值變化,；不要交換使用不同批號的盒中試劑,。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封,；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下,。
• 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之,。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質,。
• 該試劑盒zui佳反應溫度為25℃,，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

九,、儲藏條件和保質期

• 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存,，不要冷凍,。
• 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒,。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效,，不影響實驗結果，請放心使用,。

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