阿維菌素（IVM）ELISA檢測試劑盒

使用說明書

一,、檢測原理

本試劑盒利用阿維菌素抗體與阿維菌素可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì),，先在酶標(biāo)板上預(yù)包被抗原,，再加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和阿維菌素抗體,，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的阿維菌素藥物與固定在酶標(biāo)板上的抗原競爭阿維菌素抗體,，后加入底物催化顯色,。此時顯色深度與標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）中阿維菌素藥物的含量成反比。

二,、檢測范圍

本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的藥物殘留檢測產(chǎn)品,，與儀器分析技術(shù)比較，能經(jīng)濟(jì),、快速地檢測組織以及液態(tài)奶樣本中的阿維菌素,。

三、交叉反應(yīng)率

阿維菌素類……………………………………………100%

伊維菌素………………………………………………25%

埃普菌素………………………………………………10%

多拉菌素………………………………………………6%

四,、試劑盒組成

酶標(biāo)板1塊,，96孔/板

標(biāo)準(zhǔn)液6瓶（1 mL/瓶）：

0ppb,0.5ppb,1.5 ppb，4.5ppb,13.5ppb,40.5ppb

酶標(biāo)記物稀釋液 ………………………………………7mL

11×酶標(biāo)記物濃縮液………………………………0.7mL

底物液A ………………………………………………7mL

底物液B………………………………………………7mL

終止液…………………………………………………7mL

20×濃縮洗滌液……………………………………30mL

復(fù)溶工作液………………………………50mL

組織樣本處理液……………………………10mL

說明書……………………………………1份

五,、使用單位需自備的設(shè)備及試劑

（1）儀器

微孔板酶標(biāo)儀(450 nm/630 nm)

振蕩器

離心機(jī)

渦旋儀

粉碎機(jī)

電子天平（感量0.01 g）

（2）器材

單道微量移液器：20 μL～200 μL,，100 μL~1000 μL

多道微量移液器：30 μL～300 μL

（3）試劑

甲醇、去離子水

六,、溶液的配制

樣本前處理需配制：

配液1：洗滌工作液

用去離子水將濃縮洗滌液（20×）按1 : 19體積比進(jìn)行稀釋,，即1份濃縮洗滌液加19份去離子水,。

七、樣本前處理方法

樣本處理前須知：

處理任何樣本時,，都須注意：

（1）實驗中必須使用一次性吸頭,，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（2）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,，必須使用潔凈實驗器具,，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理步驟：

組織：

1,、 準(zhǔn)確稱取2±0.05g均質(zhì)后的組織樣品于10 mL離心管中,；

2、 依次加入2mL甲醇,，100μL組織樣本處理液,，充分渦動5 min使樣本分散；

3,、 室溫下（25±2℃）,，4000 g離心10 min；

4,、 取200μL上清液加入400μL復(fù)溶工作液中,，渦動10s混勻；

5,、 取50 μL用于分析,。

原奶：

1、 取1mL液態(tài)奶于10 mL離心管中,；

2,、 加入3mL甲醇，充分渦動1 min,；

3,、 室溫下（25±2℃），4000 g離心10 min,；

4,、 取200μL上清液加入400μL復(fù)溶工作液中，渦動10s混勻,；

5,、 取50 μL用于分析。

八,、酶聯(lián)免疫檢測步驟

測定前須知：

1,、使用之前將所有試劑和需用微孔板回升至室溫。

2,、使用之后立即將所有試劑放回2~8 ℃,。

3,、在使用中不要讓微孔干燥。 

4,、在ELISA分析中的重復(fù)性,，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點,。

5,、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板,。

測定步驟：

1、將所需試劑和微孔板從冷藏環(huán)境中取出,，在室溫下平衡30 min,，每種液體使用前均須搖勻。注意標(biāo)準(zhǔn)液均需做2個平行試驗,。

2,、酶標(biāo)記物工作液：取1份11×酶標(biāo)記物濃縮液加10份酶標(biāo)記物稀釋液按照1:10的比例稀釋即得。

3,、加標(biāo)準(zhǔn)品：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 mL/孔到對應(yīng)的微孔中,，加入酶標(biāo)記物50 mL/孔，輕輕振蕩混勻,，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應(yīng)30 min,。

4、洗板：小心揭開蓋板膜,，將孔內(nèi)液體甩干,，加洗滌液 300μL/孔，每次浸泡15~30 s,，充分洗滌4~5次，用吸水紙拍干,。

5,、顯色：加入底物液A液50 mL/孔，再加底物液B液50 mL/孔,，輕輕振蕩混勻,，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min。

6,、測定：每孔各加50 μL終止液,，設(shè)定酶標(biāo)儀在450 nm處，測定OD值（建議用450/630 nm雙波長檢測,，在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）,。

九,、結(jié)果分析

所測得的標(biāo)準(zhǔn)液或樣品吸光度的平均值（B）除以DI一個標(biāo)準(zhǔn)液（0標(biāo)準(zhǔn)液）的吸光度（B₀）值再乘以100%，得到百分吸光度值,。

百分吸光度值（%）＝

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的10為底的對數(shù)為X軸,， 百分吸光值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。將樣本的百分吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的值，作為10的冪,，乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品中所含阿維菌素的量。

利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,，更便于大量樣品的準(zhǔn)確,、快速分析。

九,、樣本稀釋倍數(shù)

組織： 6倍

液態(tài)奶： 10倍

十,、試劑盒靈敏度、準(zhǔn)確度,、精密度

試劑盒靈敏度：0.5ppb

樣本低檢測限：

組織……………………………………4 ppb

液體奶…………………………………5 ppb

回收率：90%±30%

精密度：試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十一,、注意事項

1、室溫低于20 ℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20~25 ℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。

2,、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,，所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3,、反應(yīng)終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚；若不慎滴漏到皮膚上,，請盡快用水沖洗,。

4、不要使用過了有效日期的試劑盒,；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑,，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑,。

5,、保存試劑盒于2~8 ℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封,；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,，因此要避免直接暴露在光線下。

6,、顯色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之；0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450 nm）值小于0.5（A_450nm< 0.5）時,，表示試劑可能變質(zhì),。

7、在加入底物液后,，一般顯色15 min即可,。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到20 min（或更長）,，但不得超過30 min,；反之，則減短反應(yīng)時間,。

8,、該試劑盒zui佳反應(yīng)溫度為25 ℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

十二,、貯藏條件及保存期

貯藏條件：在2~8 ℃保存試劑盒。

保存期：本試劑盒有效期為12個月,。