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人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒注意事項：
1.試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用,，請不要使用過期的試劑。
2.試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱,，已復溶但未用完的標準品,，請丟棄,。
3.試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品,。
4.在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測,，且加入試劑的順序應(yīng)保持*。
5.為避免交叉污染,，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭,，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.
6.濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少,，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上,，使用前請離心處理（5-10 S 即可）,，使管壁上的液體集中在管底部，取用時,，請用移液器小心吹打幾次。
7.除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外,，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分,。
8.為保證結(jié)果準確,，每次檢測均需做標準曲線。


安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液,，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護,；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸,，請用大量清水清洗,；檢測血液樣本及其它體液樣本時,，請按國家生物實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
 

自備實驗器材（不提供,，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水,，去離子水,，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒樣本收集及儲存：
1. 細胞培養(yǎng)上清：
將細胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，避免反復凍融,。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后,，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，保存過程中如有沉淀，請再次離心,，避免反復凍融,。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中,，根據(jù)標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融,。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血,、高血脂樣本,，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的值,，請將樣品做適當倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù),。 

試劑準備：
1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒,，待測樣本放置于室溫下,，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解,。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積,，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存,。
3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標準品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml),，然后在其余七管中各加入500?L標準品/樣本稀釋液（SR1），按照以下濃度進行2倍稀釋：1000,、500,、250,、125、62.5,、31.25,、15.62 pg/ml進行稀釋。500pg/ml為標準曲線點濃度,，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點（0pg/ml）。復溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝,，并將其貯存在-20～-80℃冰箱,，具體如下圖,。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻）,，請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中,。


5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制,，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心）,，請在30分鐘內(nèi)使用,。


6. 洗滌方法：
? 自動洗板：甩盡酶標板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注與吸出間隔為 30 秒,，洗板 5 次,。
? 手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干,，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩凈酶標板孔中液體,，在厚迭的吸水紙上拍干,，洗板 5 次,。

人腫瘤壞死因子αELISA試劑盒結(jié)果判斷：
1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測,，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測,，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值,。
2.計算標準品,、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值
3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標,，用軟件繪制標準曲線，樣品中TNF-α含量可通過對應(yīng)OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度,。
4.若標本 OD 值高于標準曲線上限,，應(yīng)做適當稀釋后重新檢測,，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。

1. 數(shù)據(jù)及標準曲線

2. 靈敏度：
低可檢測人 TNF-α濃度達 8pg/ml,，
20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應(yīng)的可檢測濃度,。

3. 特異性：
不與人 TNF-β，GM-CSF,，s TNF RI,，s TNF RII 反應(yīng),，小鼠 TNF-α,，s TNF RI 等反應(yīng)。

4. 重復性：
板內(nèi),，板間變異系數(shù)<10%。

5. 回收率：
在選取的健康人血漿,、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的人 TNF-α，計算回收率,。

6. 人腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫試劑盒線性稀釋：
分別在選取的 4 份健康人血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人 TNF-α，在標準曲線動力學范圍內(nèi)進行稀釋,，評估線性,。

常見問題及解決方法：