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過(guò)氧化氫酶（CAT）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

貨號(hào)：BC0205

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1、 試劑二：液體置于試劑瓶?jī)?nèi)EP管中,，使用前需先離心,。

2、 檢測(cè)工作液的配制：
A. 使用96孔UV板：取試劑二25 μL中加入5mL試劑一,，充分混勻,，作為工作液（約26T），現(xiàn)用現(xiàn)配,；也可根據(jù)樣本量按比例配制（提供1個(gè)15 mL空瓶）,。
B. 使用微量石英比色皿：取試劑二25 μL中加入6.5mL試劑一，充分混勻,，作為工作液（約34T）,，現(xiàn)用現(xiàn)配；也可根據(jù)樣本量按比例配制（提供1個(gè)15 mL空瓶）,。

產(chǎn)品說(shuō)明：

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物,、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，是最主要的H₂O₂清除酶,，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰,，CAT能夠分解H₂O₂,，使反應(yīng)溶液240nm下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而下降，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出CAT活性,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板,、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1,、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣本的制備：

a,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照每500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W,，超聲3s，間隔10s,，重復(fù)30次）,；8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測(cè),。

b、組織：按照組織質(zhì)量（g）：稱(chēng)取約0.1g組織,，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測(cè),。

2、血清（漿）樣本：直接檢測(cè),。

二,、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至240nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 測(cè)定前將CAT檢測(cè)工作液在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上,。

3、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液,，立即混勻并計(jì)時(shí),，記錄240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計(jì)算ΔA=A1-A2,。

三,、CAT活性計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）CAT活力的計(jì)算：

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位,。

CAT(U/mL)= [ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷V樣÷T=459×ΔA

2,、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷(Cpr×V樣) ÷T=459×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位,。

CAT(U/g 質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V樣總×W）÷T=459×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V樣總×500）÷T =0.917×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4L,；ε：H₂O₂摩爾消光系數(shù)，43.6 L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.01mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，1min；W：樣本質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬(wàn)；10⁶：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù),，1mol=10⁶μmol,。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）CAT活力的計(jì)算：

單位的定義：每mL血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位,。

CAT(U/mL)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷V樣÷T=764.5×ΔA

2,、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位,。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷(Cpr×V樣) ÷T =764.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位,。

CAT(U/g 質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V樣總×W）÷T=764.5×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁶]÷（V樣÷V樣總×500）÷T=1.529×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4L,；ε：H₂O₂摩爾消光系數(shù)，43.6 L/mol/cm,；d：96孔板光徑,，0.6cm；V樣：加入樣本體積,，0.01mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，1min,；W：樣本質(zhì)量，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬(wàn),；10⁶：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁶μmol,。

注意事項(xiàng)：

如果反應(yīng)液有大量氣泡產(chǎn)生,，將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

[1] Zhang Z, Liu H, Sun C, et al. A C2H2 zinc-finger protein OsZFP213 interacts with OsMAPK3 to enhance salt tolerance in rice[J]. Journal of plant physiology, 2018, 229: 100-110.

[2] Yin Y J, Chen C J, Guo S W, et al. The fight against Panax notoginseng root-rot disease using zingiberaceae essential oils as potential weapons[J]. Frontiers in plant science, 2018, 9: 1346.

[3] Yang Y, Li J, Wei C, et al. Amelioration of nonalcoholic fatty liver disease by swertiamarin in fructose-fed mice[J]. Phytomedicine, 2019, 59: 152782.

[4] Chen G, Jia Z, Wang L, et al. Effect of acute exposure of saxitoxin on development of zebrafish embryos (Danio rerio) [J]. Environmental Research, 2020: 109432.

參考文獻(xiàn)：

[1] Catalase in vitro. [J]. Methods Enzymol, 105:121-126.

[2] Johansson L H, Borg L A H. A spectrophotometric method for determination of catalase activity in small tissue samples[J]. Analytical biochemistry, 1988, 174(1): 331-336.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

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BC0210/BC0215  苯丙*酸解氨酶（PAL）活性檢測(cè)試劑盒

BC0170/BC0175  超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒

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