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輔酶 I NAD (H)含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書 

微量法

貨號：BC5195

規(guī)格：100T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 NAD標準品：臨用前加入 1.5 mL 蒸餾水,，即 2 µmol/mL,。-20℃可以保存2周。

2,、 NADH標準品：臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水,，即 2 µmol/mL。-20℃可以保存2周,。

產品說明：

輔酶I包括還原型和氧化型兩種形式,，在生物氧化中起傳遞氫的作用。氧化型輔酶I又稱煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脫氫酶的輔酶,，它在糖酵解,、糖異生,、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產物會將脫下的氫遞給NAD,，使之成為NADH（還原型輔酶I）,。而NADH則會作為氫的載體，在呼吸鏈中通過化學滲透偶聯(lián)的方式,，合成 ATP,。NAD(H)在機體內有重要的生理意義，與物質代謝,、能量代謝,、抗細胞衰老、抗氧化以及一些疾病的發(fā)生密切相關,。體內輔酶I含量降低會導致細胞損傷或衰亡,。

分別用酸性和堿性提取液提取樣本中NAD⁺和NADH,，在1-mPMS作用下,，WST-1可與NADH 反應,，產生水溶性formazan,，在450nm下有特征吸收峰,，而NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH,，進一步采用WST-1檢測,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀,、低溫離心機、水浴鍋,，研缽/勻漿器,、超聲破碎儀、可調式移液器,、微量玻璃比色皿/96孔板,、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當調整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

1、血清（漿）中NAD⁺和NADH的提?。?/span>

NAD⁺的提取：建議取0.1mL血清（血漿）,，加入0.5mL酸性提取液，煮沸5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴冷卻后，10000g,， 4℃離心10min,；取200μL上清液,，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻,，10000g 4℃離心 10min,，取上清，冰上待測,。

NADH的提?。?/span>建議取0.1mL血清（血漿），加入0.5 mL堿性提取液,，煮沸5min（蓋緊,，以防止水分散失）；冰浴冷卻后,，10000g,， 4℃離心10min；取200μL上清液,，加入200μL酸性提取液使之中和,；混勻，10000g 4℃離心 10min,，取上清,，冰上待測。

2,、組織中NAD⁺和NADH的提?。?/span>

NAD⁺的提取：建議取0.1g組織質量,，加入0.5mL酸性提取液,，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴冷卻后，10000g,， 4℃離心10min,；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和,；混勻,，10000g 4℃離心 10min,，取上清,，冰上待測。

NADH的提?。?/span>建議取0.1 g組織質量,，加入0.5 mL堿性提取液,，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴冷卻后，10000g,， 4℃離心10min,；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和,；混勻,，10000g 4℃離心 10min，取上清,，冰上待測,。

3、細胞或細菌中 NAD 和 NADH 的提?。?/span>

NAD⁺的提取：先收集細胞或細菌到離心管內,，離心棄上清，建議500萬細胞或者細菌加入0.5mL酸性提取液,，超聲波破碎（冰浴,，功率200W，超聲3s,，停10s,，重復30次），煮沸5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴冷卻后，10000g,， 4℃離心10min,；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和,；混勻,，10000g 4℃離心 10min，取上清,，冰上待測,。

NADH的提取：建議500萬細胞或者細菌加入0.5mL堿性提取液，超聲波破碎（冰浴,，功率200W,，超聲3s，停10s,，重復30次）,，煮沸 5min（蓋緊,，以防止水分散失）；冰浴冷卻后,，10000g,， 4℃離心10min；取200μL上清液,，加入200μL酸性提取液使之中和,；混勻，10000g 4℃離心 10min,，取上清,，冰上待測。

二,、測定步驟

1,、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節(jié)波長至450 nm,，分光光度計蒸餾水調零,。

2、 NAD⁺標準品：用蒸餾水稀釋為1.25,、0.625,、0.3125、0.15625,、0.078,、0.039、0.0195,、0nmol/mL的標準溶液,，0nmol/mL即空白管。

3,、 NADH標準品：用蒸餾水稀釋為10,、5、2.5,、1.25,、0.625、0.3125,、0.15625,、0.078、0nmol/mL的標準溶液,，0nmol/mL即空白管,。

4、 稀釋表（附于說明書最后）

5、 在EP管中按順序加入下列試劑：

 混勻,， 450nm下比色，讀取吸光值,，NAD⁺的記為：ΔA_NAD= A₂- A₁,，NADH的記為ΔA_NADH= A₂’- A₁’，NAD標準管的記為ΔA _NAD標= A_標-A空白管,。NADH標準管的記為ΔA _NADH標= A_標’-A空白管,。（標準曲線只需做1-2次，每個測定管需設一個對照管）

三,、NAD⁺和NADH含量計算

1,、標準曲線繪制：

（1） NAD⁺標準曲線的繪制：

根據(jù)標準管的濃度（x₁，nmol/mL）和吸光度ΔA標準（y₁,，ΔA標準）,，建立標準曲線。根據(jù)標準曲線,，將ΔA測定代入方程得到x₁（nmol/mL）,。

（2） NADH標準曲線的繪制

根據(jù)標準管的濃度（x₂，nmol/mL）和吸光度ΔA標準（y₂,，ΔA標準）,，建立標準曲線。根據(jù)標準曲線,，將ΔA′代入方程得到x₂（nmol/mL）,。

2、NAD⁺和NADH含量計算

（一）NAD⁺含量計算

（1） 按液體體積計算：NAD⁺含量(nmol/mL）= x₁×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₁

（2） 按樣本蛋白濃度計算 NAD⁺ (nmol/mg prot）= x₁×V提取÷(V提取×Cpr)= x₁ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計算NAD⁺含量(nmol/g 質量）= x₁×V提取÷W= x₁÷W 

（4） 按細胞數(shù)量計算：NAD⁺含量(nmol/10⁴ cell）= x₁×V提取÷500=0.002×x₁

（二）NADH含量計算

（1） 按液體體積計算：NADH含量(nmol/mL）= x₂×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₂

（2） 按樣本蛋白濃度計算 NADH (nmol/mg prot）= x₂×V提取÷(V提取×Cpr)= x₂ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計算NADH含量(nmol/g 質量）= x₂×V提取÷W= x₂÷W 

（4） 按細胞數(shù)量計算：NADH含量(nmol/10⁴ cell）= x₂×V提取÷500=0.002×x₂

V提?。杭尤胩崛∫后w積,，1mL；V血清：血清（漿）體積,，0.1mL,；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL,；W：樣本質量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬,。

注意事項：

1、反應過程中注意避光。

2,、如果測定吸光值超過線性范圍吸光值,，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。同步修改計算公式,。

實驗實例：

1. NAD⁺的測定：稱取約 0.1g 冬青葉片,，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.119-0.106=0.013,，標準曲線y₁=0.373x+0.0012,根據(jù)標曲得出x₁=0.032,，NAD⁺含量得：NAD⁺ (nmol/g 質量）= x₁÷W=0.32 nmol/g 質量。

NADH的測定：稱取約 0.1g 冬青葉片,，按提取步驟提取后按照測定步驟操作,，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.172-0.128=0.044，標準曲線y₂=0.1479x,根據(jù)標曲得出x₂=0.297,，NADH含量得：NADH (nmol/g 質量）= x₂÷W=2.97 nmol/g 質量,。

2. NAD⁺的測定：稱取約 0.1g 小鼠肝臟，按提取步驟提取后按照測定步驟操作,，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.119-0.105=0.014,，標準曲線y₁=0.373x+0.0012,根據(jù)標曲得出x₁=0.034，NAD⁺含量得：NAD⁺ (nmol/g 質量）= x₁÷W=3.4nmol/g 質量,。

NADH的測定：稱取約 0.1g 小鼠肝臟,，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.145-0.112=0.033,，標準曲線y₂=0.1479x,根據(jù)標曲得出x₂=0.223,，NADH含量得：NADH (nmol/g 質量）= x₂÷W=2.23 nmol/g 質量。

3. NAD⁺的測定：取0.1mL馬血清,，按提取步驟提取后按照測定步驟操作,，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.114-0.097=0.017，標準曲線y₁=0.373x+0.0012,根據(jù)標曲得出x₁=0.042,，NAD⁺含量得：NAD⁺ (nmol/g 質量）= x₁÷W=0.42 nmol/g 質量,。

NADH的測定：取0.1mL馬血清，按提取步驟提取后按照測定步驟操作,，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.142-0.135=0.007,，標準曲線y₂=0.1479x，根據(jù)標曲得出x₂=0.047,，NADH含量得：NADH (nmol/g 質量）= x₂÷W=0.47 nmol/g 質量,。

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