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NADPH-細(xì)*色素C還原酶（NCR）活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作,。

貨號(hào)：BC2725

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取一瓶加入100mL蒸餾水,，充分溶解,；用不完的試劑4℃保存可保存4周；

2,、 試劑三：臨用前取一支加入520μL蒸餾水,，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周,，避免反復(fù)凍融,。

3、 試劑四：臨用前取一支加入550μL蒸餾水,，充分溶解,；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融,。

產(chǎn)品說明：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝,。NCR作為P450酶系的重要一員,，催化氧化型P450還原再生。

NCR催化NADPH還原氧化型細(xì)*色素C,，還原型細(xì)*色素C在550nm處有特征吸收峰,；通過測(cè)定550nm吸光度的增加速率，來計(jì)算NCR活性,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、低溫離心機(jī),、超速離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋,、研缽/勻漿器,、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、粗酶液提取（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1,、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約0.5g組織,，加入4℃預(yù)冷的1mL試劑一，冰上充分研磨,，10 000g,，4℃離心30min，取上清液,，轉(zhuǎn)移到超速離心管中,。

2、粗制微粒體：4℃,，100 000g,，離心60min，棄上清液,。

3,、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解,，100 000g離心30min,，棄上清液。

4,、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加0.5mL試劑二,，蓋緊后充分震蕩溶解,，即粗酶液,，置于冰上待測(cè)。

二,、測(cè)定步驟

1,、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm,，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零,。

2、 臨用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量取出部分試劑二在37℃水浴中預(yù)熱30min,。

3,、空白管：取微量玻璃比色皿/96孔板，依次加入10μL蒸餾水,、180μL試劑二,、10μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測(cè)定2min內(nèi)吸光值變化,，測(cè)定第10s和第130s吸光值,，分別記為A1、A2。計(jì)算ΔA空白=A2-A1,。空白管只需做1-2次,。

4、測(cè)定管：取微量玻璃比色皿/96孔板,，依次加入10μL粗酶液,、180μL試劑二、10μL試劑三和10μL試劑四,，迅速混勻后于550nm處測(cè)定2min內(nèi)吸光值變化,，測(cè)定第10s和第130s吸光值，分別記為A3,、A4,。ΔA測(cè)定=A4-A3。

三,、NCR活性計(jì)算

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃條件下,，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)*色素C為1個(gè)酶活單位。

NCR ((nmol/min /mg prot)= (ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

= 550×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃條件下,，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)*色素C為1個(gè)酶活單位,。

NCR ((nmol/min/g 質(zhì)量)= (ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=275×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷W

ε：還原型細(xì)*色素C摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積,，210μL=2.1×10^-4L,；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定,；V樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積,，10μL=0.01mL；V樣總：樣本處理中最后加入試劑二體積,，0.5mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；T：反應(yīng)時(shí)間,，2min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

將上述計(jì)算公式中比色皿光徑d=1cm改為d=0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可,。

注意事項(xiàng)：

1,、如果測(cè)定吸光值A＞1.5或ΔA＞1，建議稀釋樣本后再測(cè)定,，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù),。

2,、如果測(cè)定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定,，注意同步修改計(jì)算公式,。

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