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亞硝酸還原酶（NiR）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作,。

貨號：BC1545

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1,、 試劑二：每瓶臨用前加入2.5mL蒸餾水充分溶解,，2-8℃保存2周；

2,、 試劑三：臨用前加入5mL蒸餾水,，可70-80℃加熱溶解；2-8℃可以保存3個月,；

3,、 試劑五：若出現(xiàn)沉淀，可70-80℃加熱溶解,；

4,、 標(biāo)準(zhǔn)品：10µmol/mL亞硝*標(biāo)準(zhǔn)溶液；

5,、 工作液：臨用前根據(jù)樣本量將試劑四和試劑五按1:1的比例混合,，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

亞硝酸還原酶（Nitrite reductase,，NiR）是亞硝態(tài)氮還原過程中的關(guān)鍵酶，在自然界氮素循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用,，其廣泛存在于微生物及植物體內(nèi),，能夠催化亞硝酸鹽還原，減少亞硝態(tài)氮在環(huán)境中的積累,，降低其對生物體生長發(fā)育的毒害作用,。

亞硝酸還原酶可將NO₂^-還原為NO，使樣本中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO₂^-減少,，即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)樣本中亞硝酸還原酶的活性,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、低溫離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、微量玻璃比色皿/96孔板,、天平、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按樣本質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）1 : 5~10比例（建議稱取0.1g樣本,，加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后,，于4 ℃,，10000g，離心10min,，棄沉淀,，取上清液置于冰上待測。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞：按細(xì)胞數(shù)量（10⁴）：提取液體積（mL）500~1000 : 1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1.0mL提取液）加入提取液,，冰浴超聲破碎細(xì)胞（功率200w,，超聲3s，間隔7s,，總時間3min）,，然后于4℃，10000g,，離心10min,，棄沉淀，取上清液置于冰上待測,。

二,、測定步驟

1,、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至540nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零,。

2,、 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將10µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋至0.2,、0.1、0.05,、0.025,、0.0125、0.00625,、0.003125 µmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待測,。

3、 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表：

備注：下述實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需70µL標(biāo)準(zhǔn)液（注意不要在此步驟直接檢測吸光值）,。

4,、 樣本測定：

三,、亞硝酸還原酶活性計算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸（x，μmol/mL）,，標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸（y,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b,，將ΔA測定帶入方程得到x（μmol/mL）。

2. 酶活計算

（1）按照蛋白濃度計算

酶活單位定義：每mg組織蛋白每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位,。

NiR（U/mg prot）=x×V1÷V2×V提÷（Cpr×V提）÷T=x×7÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每g組織每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位,。

NiR（U/g 質(zhì)量）=x×V1÷V2×V提÷W÷T=x×7÷W

（3）按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每10⁴個細(xì)菌/細(xì)胞每小時還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（U/10⁴ cell）=x×V1÷V2×V提÷細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量÷T=x×7÷細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量

V1：取上清液前的反應(yīng)體系體積,，0.14mL,；V2：加入的樣本體積，0.02mL,；V提：加入的提取液體積，1.0mL,；T：反應(yīng)時間,，1h；W：土樣質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量：以10⁴計,。

實驗實例：

1,、 取0.1g楊樹葉片加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，按照測定步驟操作,，用96孔板測得計算ΔA測定= A基質(zhì)管-（A測定管-A對照管）=0.863-（0.705-0.065）=0.223,，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=8.4313x+0.003，R²⁼0.9999,，計算x=0.0261,，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

NiR（U/g 質(zhì)量）=x×7÷W=0.0261×7÷0.1=1.827 U/g 質(zhì)量。

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