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蔗糖磷酸化酶（SP）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號：BC0450
規(guī)格：50T/48S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入15 mL蒸餾水,，充分混勻,。2-8℃可以保存4周；

2. 試劑四：臨用前取1瓶加入1.5 mL蒸餾水,，充分混勻,。分裝后-20℃保存，避免反復凍融,，可以保存2周,；

3. 試劑五：粉劑置于瓶內玻璃管中。臨用前加入10 mL蒸餾水,，充分混勻,。-20℃分裝保存,，避免反復凍融，可以保存4周,；

4. 試劑六：臨用前取1支加入1 mL蒸餾水,，充分混勻；可分裝后-20℃保存,，避免反復凍融,，-20℃可以保存2周；臨用前按試劑六：蒸餾水=1:1的比例稀釋試劑六,，現(xiàn)用現(xiàn)配,；

5. 試劑七：臨用前取1支加入0.7 mL蒸餾水，充分混勻,；可分裝后-20℃保存,，避免反復凍融，-20℃可以保存2周,；臨用前按試劑七：蒸餾水=1:1的比例稀釋試劑七,，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產品說明：
蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,，屬于糖基水解酶13家族,，是一種催化轉移葡萄糖苷鍵的酶，能夠催化蔗糖和無機磷酸鹽合成1-磷酸-葡萄糖,。該酶主要以蔗糖,、1-磷酸葡萄糖為供體，多類物質如多羥基的糖和糖醇,、酚羥基,、羧基等為受體，催化合成各種糖苷,。
SP能夠催化蔗糖產生1-磷酸葡萄糖,，在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP⁺生成NADPH,，導致340nm光吸收值增加,。通過340nm吸光度的增加速率來反映SP活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫離心機,、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋,、可調式移液器、研缽/勻漿器,、1mL石英比色皿,、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一,、樣本處理（可適當調整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質量(g)︰提取液體積(mL)為1︰5-10的比例（建議稱取約0.1 g組織,，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿,，然后10000g，4℃,，離心10min ,，取上清置于冰上待測。
2,、細胞或細菌：先收集細胞或細菌到離心管內,，3000rpm離心5min后棄上清；按照細胞或細菌數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500-1000︰1的比例（建議500萬個細胞或細菌加入1 mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200 W,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后10000g，4℃,，離心10min ,，取上清置于冰上待測。
3,、液體：直接檢測,。若液體渾濁可離心后取上清測定。
二,、測定步驟

1. 紫外分光光度計預熱30 min以上,，調節(jié)波長至340 nm，蒸餾水調零,。

2. 試劑一37℃預熱10min,。

3. 操作表：

三,、蔗糖磷酸化酶（SP）活性計算
(1) 按照蛋白濃度計算
酶活定義：37℃,，每毫克蛋白質每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T =803.85×ΔA÷Cpr
(2) 按照樣本質量計算
酶活定義：37℃,，每克樣本每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位,。
SP活性（U/g 質量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T=803.85×ΔA÷W
(3) 按照細胞數(shù)量計算
酶活定義：37℃，每10⁴個細胞每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位,。
SP活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量（萬個）)÷T
= 803.85×ΔA÷細胞數(shù)量（萬個）
ε：NADPH摩爾消光系數(shù),，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V反總：反應體系總體積，0.001L,；V樣：反應體系中樣本體積,，0.1mL；V樣總：提取液體積,，1mL ,；W：樣本質量，g,；Cpr：蛋白濃度,，mg/mL；T：反應時間,，2min,；10⁹：1mol=10⁹nmol。
注意事項：

1. 如果測定吸光值A＞1.5,，建議用提取液稀釋樣本后再測定,，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測定吸光值較低或接近空白OD值,，建議增加樣本量后再進行測定,。

實驗實例：

1. 
   

1. 
   

2. 稱取0.1 g土豆，加入1 mL提取液,，冰浴勻漿,，10000 g，4℃條件下離心10 min,；取上清置于冰上待測,。使用1mL石英比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=（0.5620-0.4300）-（0.059-0.059）=0.132,，按公式計算活性：

3. 
   

SP活性（U/g 質量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T =1061.1 U/g質量

1. 
   

1. 
   

2. 稱取0.1 g黑米,，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，10000 g,，4℃條件下離心10 min,；取上清置于冰上待測。使用1mL石英比色皿按照測定步驟操作,，計算ΔA=（0.7290-0.6030）-（0.059-0.059）=0.126,，按公式計算活性：SP活性（U/g 質量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T=1012.85U/g質量

3. 
   

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