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果糖激酶（FRK）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號：BC5920

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：臨用前將粉劑一溶于提取液中,；該試劑為懸濁液,，使用前搖勻即可，2-8℃保存12周,；

2. 試劑一：試劑放于試劑瓶內(nèi)玻璃管中。臨用前加入6mL蒸餾水,，充分溶解，溶解后的試劑-20℃分裝保存4周,，避免反復凍融,；

3. 試劑二：試劑放于試劑瓶內(nèi)玻璃管中,。臨用前加入6mL蒸餾水，充分溶解,，溶解后的試劑-20℃分裝保存4周,，避免反復凍融,；

4. 試劑三：試劑放于試劑瓶內(nèi)玻璃瓶中,，臨用前加入6mL蒸餾水溶解,，溶解后的試劑2-8℃分裝保存4周,；

5. 試劑五工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑五：蒸餾水=8μL: 1000μL（共1008μL,，約20T）的比例配制,，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用,；

6. 試劑六：臨用前取一支試劑六加入1mL蒸餾水,，充分溶解。溶解后的試劑-20℃分裝保存2周,，避免反復凍融,。（該試劑為凍干試劑，可能存在不同瓶間肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象,，此現(xiàn)象不影響使用,，實際質(zhì)量相同）

產(chǎn)品說明：

果糖激酶（Fructokinase，FRK,，EC 2.7.1.4）是催化果糖磷酸化的主要酶。果糖激酶可以作為植物的己糖感受器和信號分子,，通過影響植物的生長周期來調(diào)控植物的代謝和生長發(fā)育進程，果糖磷酸化對于維持淀粉生物合成方向具有重要意義。

FRK催化果糖合成6-磷酸果糖,，6-磷酸果糖在磷酸己糖異構(gòu)酶的作用下異構(gòu)為6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADH,，NADH在340nm有特征吸收峰,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、低溫離心機,、分析天平,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL石英比色皿,、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿

器/細胞超聲破碎儀,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：按樣本質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）=1 : 5~10比例加入提取液（建議稱取0.1g樣本,，加入1.0mL提取液）,，冰浴勻漿后，于4℃,，8000g，離心10min,，棄沉淀，取上清液置于冰上待測,。

2. 細胞樣本：按細胞數(shù)量（10⁶）：提取液體積（mL）=5~10 : 1的比例加入提取液（建議5百萬細胞加入1.0mL提取液），冰浴超聲破碎細胞（功率200W,，超聲3s，間隔7s,，總時間3min）,，然后于4℃,，8000g,，離心10min，棄沉淀,，取上清液置于冰上待測,。

3. 液體樣本：直接測定。若液體有渾濁則離心取上清測定,。

二,、 測定步驟

1．紫外分光光度計預熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2．試劑四37℃預熱15min。

3．在1mL石英比色皿按下表順序加樣：

三、FRK活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：在37℃溫度下每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個酶活單位,。

FRK活性（U/mg prot）=ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：在37℃溫度下每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol的NADH定義為一個酶活單位。

FRK活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹÷(W÷V提取×V樣) ÷T =321.54×ΔA÷W

3. 按細胞數(shù)目計算

單位的定義：在37℃溫度下每10⁶個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol的NADH定義為一個酶活單位,。

FRK活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹÷(N÷V提取×V樣) ÷T =321.54×ΔA÷N

4. 按液體體積計算

單位的定義：在37℃溫度下每毫升每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol的NADH定義為一個酶活單位。

FRK活性（U/mL）=ΔA÷(ε×d)×V反總×10⁹÷V樣÷T =321.54×ΔA

ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：1mL石英比色皿光徑,，1cm；V反總：反應總體積,，1×10^-3L；10⁹：單位換算,，1mol=10⁹nmol；V樣：加入樣本體積,，0.1mL,；V提取：提取液體積,，1mL； Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g；N：細胞數(shù)目,，以10⁶計；T：反應時間,，5min,。

注意事項：

1. 如果?A小于0.005,，可以增加樣本量或延長反應時間再進行測定；如果?A測定大于0.6或A1測定小于A1空白,，建議將樣本稀釋或者縮短反應時間再進行測定。注意同步修改計算公式,。

實驗實例：

1. 取0.1023g土豆組織樣本，加入提取液進行冰浴勻漿,，離心后取上清，按照測定步驟操作,，用1mL石英比色皿測得計算：ΔA測定=A2測定-A1測定=0.165-0.092=0.073，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.013-0.012=0.001,，ΔA=ΔA測定- ΔA空白=0.072。按樣本質(zhì)量計算得：

FRK活性（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W = 226.304 U/g 質(zhì)量,。

2. 取0.06g酵母粉，加入提取液進行冰浴勻漿,，離心后取上清，按照測定步驟操作,，用1mL石英比色皿測得計算：ΔA測定=A2測定-A1測定=0.737-0.237=0.5，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.013-0.012=0.001,，ΔA=ΔA測定- ΔA空白=0.499。按樣本質(zhì)量計算得：

FRK活性（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W =2674.141 U/g 質(zhì)量,。

參考文獻：

[1] Giroix M H, Jijakli H, Courtois P, et al. Fructokinase activity in rat liver, ileum, parotid gland, pancreas, pancreatic islet, B and non-B islet cell homogenates.[J].International Journal of Molecular Medicine, 2006, 17(3):517-522.

[2] Kurt, Bergbauer, Ralf, et al. Studies on Fructose Metabolism in Cultured Astroglial Cells and Control Hepatocytes: Lack of Fructokinase Activity and Imrrunoreactivity in Astrocytes[J].Developmental Neuroscience, 2009, 18(5-6):371-379.

[3] Schaffer A A, Petreikov M. Inhibition of fructokinase and sucrose synthase by cytosolic levels of fructose in young tomato fruit undergoing transient starch synthesis[J].Physiologia Plantarum, 2010, 101(4):800-806.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0740/BC0745  己糖激酶（HK）活性檢測試劑盒

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